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丹酚酸B-TAT脂质体对HSF细胞增殖、侵袭和细胞周期的影响
制备载丹酚酸B的穿膜肽TAT修饰脂质体(SAB-TAT-LIP),研究其对人皮肤成纤维细胞(HSF)生长增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响,初步评价其用于防治增生性瘢痕的效果.以体外培养的HSF细胞为研究对象,采用四甲基偶氮唑盐MTT法检测SAB-TAT-LIP对细胞生长增殖的抑制作用;采用Transwell小室法和划痕法检测SAB-TAT-LIP对细胞侵袭和迁移能力的影响;采用流式细胞术检测细胞周期变化.空白脂质体对HSF细胞基本无毒副作用,不同浓度的SAB-TAT-LIP干预HSF细胞不同时间后,均具有一定的增殖抑制作用,且呈现剂量和时间依赖性,同时细胞迁移和侵袭能力明显降低;SAB-TAT-LIP干预HSF细胞48 h后,可使细胞周期阻滞于G0/G1期,与空白对照组相比,P＜0.01.SAB-TAT-LIP对HSF细胞的增殖、侵袭和迁移有显著的抑制作用,对细胞周期G0/G1期有阻滞作用.
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穿膜肽TAT修饰载丹酚酸B脂质体的制备及其抑制人皮肤成纤维细胞增殖与迁移初步研究
目的 制备具有防治增生性瘢痕(HS)作用的载丹酚酸B的穿膜肽TAT修饰脂质体(SAB-TAT-LIP),建立其质量评价方法,并初步考察其对体外人皮肤成纤维(HSF)细胞增殖和迁移的影响.方法 采用pH梯度逆向蒸发法制备脂质体,超滤法测其包封率,以包封率为评价指标,采用Box-Behnken响应面法优化脂质体的处方工艺;考察其形态、粒径、Zeta电位、体外释放、体外透皮吸收和稳定性等理化性质;在此基础上采用MTT法考察其对HSF细胞增殖的作用,采用划痕法和Transwell小室法考察其对HSF细胞迁移和侵袭的作用.结果 SAB-TAT-LIP的药物包封率为(86.70±0.85)％,平均粒径为(219.90±5.09) nm,Zeta电位(-9.25±0.92) mV,体外24 h累积释放率为62.49％,无突释效应,体外32 h皮肤累积透过率为17.21％,透过速率为(28.33±4.9)μg/(cm2·h),真皮层滞留量为(44.39±6.87) μg/cm2,4℃放置10 d稳定性良好.SAB-TAT-LIP能够显著地抑制HSF细胞的增殖、迁移和侵袭,与对照组相比,差异显著(P＜0.01).结论 优化得到的SAB-TAT-LIP包封率较高、粒径较小,体外释放和透皮行为均满足局部透皮给药制剂的体外释放和透皮规律,对体外HSF细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用.
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穿膜肽-TDRG1重组蛋白原核表达载体的构建
构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体.以pYD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段.同时利用内切酶对已构建好的载体pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证.PCR扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致.成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT.
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穿膜肽修饰的载顺铂磁性纳米复合物的制备及其对鼻咽癌的体外效应
目的:制备具有穿膜作用的载顺铂磁性纳米复合物,并探究其对鼻咽癌的体外作用.方法:以醛基化海藻酸钠(ASA)改性的磁性纳米粒(ASA-MNPs)作为药物载体,将端氨基聚乙二醇(PEG)化的穿膜肽(TAT)与ASA通过醛胺缩合链接,组装成TAT修饰的载顺铂磁性纳米复合物,并依据配位络合的原理偶联顺铂(TAT-ASA-MNP@CDDP).通过核磁氢谱、红外光谱等对载药磁性纳米复合物进行表征,通过荧光标记观察其穿膜能力,评估其生物相容性,采用CCK-8细胞毒性实验及流式细胞术评估其对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制作用.结果:核磁氢谱和红外光谱显示TAT-ASA-MNP@CDDP分别具有TAT、PEG、ASA特征峰,其水流动力学粒径为(145.9±1.5) nm,zeta电位为(-21.66±1.24)mV,顺铂载量为(25.03±3.05)％.荧光标记显示,CNE-2能快速摄取TAT-ASA-MNP@CDDP.TAT-ASA-MNPs载体细胞毒性实验显示,共培养72 h后(载体铁浓度10 μg/ml),293T细胞的细胞存活率大于70％,人红细胞凝聚试验阴性.体外细胞毒性实验及凋亡实验显示,在顺铂浓度相对较低时,TAT-ASA-MNP@CDDP对CNE-2细胞的抑制作用比ASA-MNP@CDDP大(P＜0.05).结论:单纯载体无明显细胞毒副作用,生物相容性良好,成功制备的TAT-ASA-MNP@CDDP对CNE-2细胞具有明显体外抑制效应.
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载丹酚酸B的穿膜肽TAT修饰脂质体对HSF细胞凋亡和TGF-β1表达水平的影响
目的 制备载丹酚酸B的穿膜肽TAT修饰脂质体(SAB-TAT-LIP),研究其对人皮肤成纤维HSF细胞凋亡和TGF-β1表达水平的影响,初步评价其用于防治增生性瘢痕的效果.方法 采用pH梯度逆向蒸发法制备SAB-TAT-LIP;以体外培养的HSF细胞为研究对象,采用膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)双染法检测SAB-TAT-LIP对细胞凋亡的影响,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测SAB-TAT-LIP对细胞分泌TGF-β1的影响.结果 空白脂质体对HSF细胞基本无毒副作用,SAB-TAT-LIP干预HSF细胞48 h后,细胞早期凋亡率、中晚期凋亡率和总凋亡率都明显增加,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);TGF-β1分泌量显著降低,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 SAB-TAT-LIP对HSF细胞凋亡有促进作用,对TGF-β1的表达水平有下调作用.
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穿膜肽TAT的固相合成及体外活性研究
目的 以固相合成法合成穿膜肽TAT,并对合成产物进行活性评价.方法 采用Na-芴甲氧羰基(fluorenyl-methyloxyloxycarbonyl,FMOC)作为α-氨基的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成穿膜肽TAT.应用高效液相色谱和质谱仪测定其纯度及相对分子质量;荧光显微镜观察穿膜肽TAT介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green flutescent pro-tein,pEGFP)质粒在体外培养人脐静脉内皮细胞中的转染效果以评价穿膜肽TAT的生物活性;MTT法检测穿膜肽TAT与质粒DNA复合物对人脐静脉内皮细胞生长活性的影响.结果 高效液相色谱和质谱鉴定所制备穿膜肽TAT的纯度为96.6%,相对分子质量1 880.它能够携带质粒DNA穿过细胞膜进行基因转染,并对细胞活性无明显影响.结论 采用Fmoc固相肽合成法可以成功地合成有生物活性的穿膜肽TAT.
