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铁皮石斛DcCDPK8基因启动子克隆及功能分析
铁皮石斛钙依赖性蛋白激酶基因DcCDPK8参与低温激素ABA和MeJA的信号转导过程,但转录调控尚不明确,为了研究铁皮石斛DcCDPK8基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,采用PCR技术克隆铁皮石斛DcCDPK8基因启动子序列,并利用5'端缺失和GUS基因的融合表达研究启动子序列功能.结果表明DcCDPK8基因启动子序列含有1个低温响应元件LTR(-1 749~-614 bp),2个茉莉酸甲酯响应元件(-1 749~-230 bp)和1个ABA响应元件(-614~-230 bp),构建3个5'端不同缺失片段融合GUS报告基因的pBI121真核表达载体,瞬时转化烟草叶片,经低温胁迫后GUS活性强弱为DcCDPK8-p1> DcCDPK8-p2> DcCDPK8-p3,经外源ABA诱导后GUS活性DcCDPK8-p1> DcCDPK8-p2> DcCDPK8-p3,而经外源MeJA诱导后GUS活性DcCDPK8-p1> DcCDPK8-p2> DcCDPK8-p3,推测DcCDPK8基因启动子序列中ABA响应元件(ARE)对外源ABA的响应起正调控作用,而MeJA顺式作用元件对外源茉莉酸甲酯响应起抑制作用.
关键词: 铁皮石斛 DcCDPK8启动子 瞬时转染 组织化学染色 -
人sTNFR1真核表达载体构建及体外抑制TNF-α细胞毒效应
目的 构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,研究sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用.方法 以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1(-).sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,半定量PT-PCR法检测sTNFR1 mRNA的表达,MTT法检测sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用.结果 人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);通过与3-磷酸甘油醛(GAPDH)比较,pcDNA3.1(-)-sTNFR1转染的QSG7701细胞中sTNFR1 mRNA表达量明显高于空载体对照组和空细胞对照组(P<0.05);pcDNA3.1(-)-sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,TNF-α对其细胞毒性作用受到抑制,当TNF-α浓度为100μg/L时pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞毒性较QSG7701下降64.8%.结论 成功地构建真核表达质pcDNA3.1(-)-sTNFR1,TNF-α对瞬时转染pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞株细胞毒性作用受到抑制.
关键词: 人可溶性肿瘤坏死因子受体1 真核表达 瞬时转染 细胞毒性作用 -
建立基于自主复制型载体的端粒酶转录调节细胞系
端粒酶通过催化端粒合成,保持端粒长度,从而保证细胞的持续分裂能力.其活性与生殖细胞和干细胞的增殖,体细胞的衰老和异常增殖、癌变等病理生理过程密切相关[1].逆转录催化亚单位hTERT的转录调节是端粒酶活性调节中的限速步骤[2],然而,目前对hTERT基因表达的具体机制仍不明了.研究基因转录调控的体内方法多通过瞬时转染及检测报告基因表达情况来分析启动子活性.由于众多因素的存在,这种瞬时转染的敏感性较低、重复性差.
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CD/5-FC自杀基因体系对肝、胆、胰肿瘤细胞的杀伤作用及机制
目的:通过CD/5-FC自杀基因体系对肝BEL-7402、胆QBC、胰BXPC-3三系肿瘤细胞杀伤效率的比较,探讨影响这种杀伤差异的可能机制.方法:测定BEL-7402、QBC、BXPC-3三系肿瘤细胞的生长周期及倍增时间.FACS测定阳离子脂质体介导的三系肿瘤细胞瞬时转染效率.MTT法测定阳离子脂质体介导CD/5-FC自杀基因体系对瞬时转染的肝胆胰三系肿瘤细胞体外杀伤效率.观察细胞倍增时间与转染效率与杀伤效率之间的关系.FACS对三系肿瘤细胞瞬时转染自杀基因后凋亡进行比较,并用H0chest33342染色后进行观察.结果:BEL-7402、QBC、BXPC-3的倍增时间分别是34.48、64.94、26.29 h.QBC细胞同BEL-7402及BXPC-3相比差异有显著性(P<0.05):BEL-7402、QBC、BXPC3三系细胞阳离子脂质体介导的转染率分别为26.99%、2.25%、30.36%.BEL-7402和BXPC-3同QBC细胞有显著差异(P<0.05);瞬时转染自杀基因后抑制效率分别为83.24%,16.97%,92.32%;在CD/5-FC杀伤三系细胞可能的机制-凋亡的研究中,三者凋亡率分别为27.8%,5.49%,36.5%.结论:生长周期短,倍增时间快的细胞系瞬时转染率高,对CD/5-FC自杀基因疗法比较敏感,该自杀基因疗法可能对临床晚期消化系恶性肿瘤是一种很有前景的治疗方法.
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核孔复合体相互作用蛋白(NPIP)对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用
目的:构建HBV核心启动子及NPIP的重组载体,研究NPIP对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及NPIP的序列设计引物,用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和NPIP基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在NPIP的影响下,其活性有降低3-4倍.通过体内实验证明NPIP可以下调HBV核心启动子的表达.结论:NPIP明显降低HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的线索.
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反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染对人肝癌细胞生长的抑制作用
目的:利用反义核酸技术,研究体外胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)反义寡核苷酸转染对肝癌细胞增生、分化及凋亡的影响,探讨寡核苷酸转染治疗肝癌的可行性.方法:合成针对IGF-Ⅰ的寡核苷酸片段,利用脂质体包裹反义IGF-Ⅰ寡核苷酸片段瞬时转染人肝癌细胞系BEL-7402细胞,MTT法检测细胞增生;放免法检测培养细胞上清中AFP,CEA的分泌量;免疫组化法检测转染细胞AFP,PCNA表达的变化;采用末端标记(Tunel)法检测细胞凋亡的变化.结果:MTF法检测转染反义IGF-Ⅰ寡核苷酸的人肝癌细胞系BEL-7402A值由0.44±0.09下降为0.30±0.07(P<0.01),上清液AFP和CEA水平分别由12.5±2.2 μg/L和6.8±2.3μg/L下降为2.5±0.3μg/L和2.2±1.5μg/L(P<0.01,P<0.05),凋亡阳性细胞数由16.4±2.3%增加至23.1±3.7%(P<0.05).结论:反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染人肝癌细胞系BEL-7402细胞可以降低细胞增生,减少细胞去分化并诱导肝癌细胞凋亡.
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乙型肝炎病毒X蛋白上调前-X基因启动子表达活性
目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)对前-X基因启动子的调节作用,研究HBxAg在HBV致病的分子生物学机制中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV前X基因启动子,以T-A克隆法,将前-X基因启动子(promoter)的基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pGEMT-前-X-promoter与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnⅠ和BglⅡ双酶切后构建前-X启动子报告基因表达载体pCAT3-前-X-promoter,以重组表达质粒pCAT3-前-X-promoter分别与pcDNA3.1空载体和HBxAg表达载体pcDNA-HBxAg瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HBxAg对前X基因启动子的调节作用.结果:构建的报告载体pCAT3-前-X-promoter经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(-)-X和pCAT3-前-X-promoter共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3启动子的3.12倍,是pCAT3-前-X-pro-moter的2.65倍,是pCAT3-3.1空载体和pCAT3-前-X-promoter共转染的2.28倍.结论:HBxAg可以上调乙型肝炎病毒基因组中前-X基因启动子的活性.
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丙型肝炎病毒核心蛋白上调细胞周期调节蛋白Wee1基因表达研究
目的:了解丙型肝炎病毒核心蛋白和细胞周期调节蛋白Wee1基因表达的关系,研究HCV核心蛋白在HCV致病的分子生物学机制中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)扩增Wee1基因启动子,命名为Weep.以T-A克隆法,将Weep基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pT-Weep,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnI和XhoI双酶切后构建Weel启动子报告载体pCAT3-Weep,分别以重组报告载体pCAT3-Weep和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.应用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HCV核心蛋白对Wee1基因启动子的反式激活作用.结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-core和报告载体pCAT3-Weep经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-Weep和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3空载体的3.4倍,pCAT3-Weep的2.3倍.结论:丙型肝炎病毒核心蛋白可反式激活Wee1基因启动子,进而上调细胞周期调节基因Wee1的表达.
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表达谱基因芯片技术研究甘草甜素上调白介素-18基因的表达
目的:了解甘草甜素调节白介素-18(IL-18)基因启动子的活性,为甘草甜素的作用机制提供理论依据.方法:应用基因表达谱芯片技术对于甘草甜素刺激HepG2细胞之后的基因表达谱进行研究.聚合酶链反应(PCR)扩增IL-18基因启动子,命名为IL-18P.以T-A克隆法,将IL-18P基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pT-IL-18P,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnI和Bg1Ⅱ双酶切后构建IL-18启动子报告基因表达载体pCAT3-IL-18P,以重组表达质粒pCAT3-IL-18P瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,甘草甜素刺激后24 h后收获细胞.用酶联免疫黏附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性.结果:表达谱基因芯片研究结果表明,甘草甜素可上调IL-18基因表达水平达2.815倍.构建的报告载体pCAT3-IL-18P经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-IL-18P和甘草甜素瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3空载体的7.7倍,pCAT3-IL-18P的1.5倍.结论:甘草甜素可以上调IL-18启动子的活性,进而上调IL-18基因的表达.为深入了解甘草甜素的免疫调节作用及其在病毒的清除过程中的作用机制提供新的理论依据.
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丙型肝炎病毒核心蛋白上调NIP3基因表达研究
目的:了解丙型肝炎病毒核心蛋白和NIP3基因的表达的关系,研究HCV核心蛋白在HCV致病的分子生物学机制中的作用.方法:聚合酶链反应(PCR)扩增NIP3基因启动子,以T-A克隆法,将NIPP基因片段连入载体pGEM-T.获得的质粒pT-NIPP,和报告质粒pCAT3-basic分别用SacI和Bg1Ⅱ双酶切后构建报告载体pCAT3-NIPP,分别以重组报告载体pCAT3-NIPP和pcDNA3.1(-)-core应用FuGENE 6转染试剂瞬时转染NIH3T3细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.应用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HCV核心蛋白对NIP3基因启动子的反式激活作用.结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-core和报告载体pCAT3-NIPP经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-NIPP和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染的NIH3T3细胞中的CAT表达活性为pCAT3-NIPP的1.9倍,是pCAT3 basic的3.6倍,明显升高.结论:丙型肝炎病毒核心蛋白可反式激活NIP3基因启动子,进而上调NIP3基因的表达.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法:以HCV非结构蛋白NS3反式调节基因的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRDl的启动子区域(TXNRDlp),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRDlp,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS3共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:成功获得TXNRDl启动子的正确克隆.CAT3-TXNRDlp和pcDNA3.1(-)-NS3瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9倍,pCAT3-TXNRDlp的2.0倍,进一步验证了利用基因表达谱技术研究HCV NS3蛋白反式激活作用的结果.结论:TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS3蛋白具有对TXNRD1的反式激活作用.
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羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关.为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN).CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用.CPN是分子量280 kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83 kD调节亚单位.核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA.前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录.前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用.核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621 nt).CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达.方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点.用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上.核心启动子经MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞.结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp.重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功.脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加.通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础.
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小鼠AFP-CTLA4融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定
目的:克隆小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因并构建小鼠甲胎蛋白-细胞毒性T淋巴细胞抗原4(mAFP-CTLA4)融合蛋白真核表达载体.方法:从Hepal-6细胞中提取总RNA进行RT-PCR,扩增出mAFP基因,亚克隆于pcDNA3.1载体.PCR法从质粒pmCTLA4-Ig中克隆出mCTLA4膜外部分基因并通过重叠PCR法添加接头,重组连接于pmAFP质粒中mAFP基因后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆酶切、测序鉴定.用质粒瞬时转染CHO细胞,Westernblot检测融合蛋白的表达.结果:利用RT-PCR从Hepal-6细胞总RNA中成功克隆出1.8kb的nAFP基因;重组阳性克隆经酶切鉴定证实连有接头的CTLA4膜外部分基因已正确插入pmAFP质粒中,测序结果证实各片段连接方向及阅读框正确.用质粒瞬时转染CHO细胞,Western blot检测到预计大小分子量蛋白的表达.结论:mAFP-CTLA4融合蛋白真核表达载体的构建成功,为进一步研究其在肝癌免疫治疗中的作用奠定了基础.
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小鼠甲胎蛋白基因的克隆真核表达载体构建及表达鉴定
目的:克隆小鼠甲胎蛋白(AFP)基因,构建小鼠AFP真核表达载体并进行表达鉴定.方法:从Hepal-6细胞中提取总RNA进行RT-PCR,克隆出小鼠AFP基因,亚克隆于pcDNA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切和测序鉴定.重组质粒瞬时转染CHO-K1细胞,Western blot检测小鼠AFP的表达.结果:利用RT-PCR从Hepal-6细胞总RNA中成功克隆出1.8kb的小鼠AFP基因,重组阳性克隆经酶切和测序鉴定证实目的基因已正确插入pcDNA3.1载体中,Western blot结果证实重组质粒pmAFP能够在CHO-K1细胞中正确表达.结论:小鼠AFP真核表达载体构建成功,为进一步研究其在肝癌免疫治疗中的作用奠定了基础.
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瞬时转染CD44反义寡核苷酸抑制人胃癌MGC80-3细胞增生并诱导凋亡
目的:研究CD44反义寡核苷酸(CD44ASODN)对人胃癌MGC80-3细胞的增生抑制和诱导凋亡的作用和机制.方法:设计并合成CD44ASODN,脂质体介导转入MGC80-3胃癌细胞,采用流式细胞术(FACS)检测CD44、Fas的表达及细胞凋亡;RT-PCR法检测CD44mRNA的表达;MTT法检测细胞增生.结果:CD44ASODN(1.6 μmol/L)明显地抑制MGC80-3细胞CD44mRNA和蛋白表达水平.CD44ASODN作用MGC80-3细胞48 h后,细胞的增生呈现明显的抑制作用,其抑制率为31.0%,72,96 h的抑制率分别为46.3%、49.6%(P<0.01),其增生抑制作用呈时间依赖效应.在CD44配体低分子质量透明质酸存在的环境中,CD44ASODN能显著增高细胞表面Fas分子的表达,表达率从6.7%提高为16.8%(P<0.01),并显著地增加MGC80-3细胞对FasmAb诱导凋亡的敏感性,凋亡率从0增加到26.5%(P<0.01).结论:CD44反义寡核苷酸通过抑制MGC80-3细胞CD44mRNA和蛋白表达,抑制MGC80-3细胞的增生,增高细胞表面Fas的表达及MGC80-3细胞对FasmAb诱导凋亡的敏感性,逆转胃癌细胞的免疫逃逸作用.
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TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响
目的:TGIF(TGinteractingfactor)是TGF-β和视黄醛信号传导通路的抑制分子,且MAPK通路的活化能延长其半衰期,但他在肿瘤发生中的作用尚不清楚,本研究旨在探讨TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响.方法:将TGIF反义寡核酸瞬时转染胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR检测转染效率,MTT法检测胃癌细胞的增生速度,流式细胞术分析转染细胞的细胞周期和凋亡率的变化.结果:SGC-7901细胞转染TGIF反义寡核苷酸后,细胞增生受到部分抑制,72h后,他的抑制率达20.4%,但细胞的凋亡和细胞周期分布无明显改变.TGF-β1处理后,与突变寡核苷酸转染组细胞和未转染组细胞相比,TGIF反义寡核苷酸转染的SGC-7901细胞的增生受到明显抑制(30%),G1期细胞含量增加更明显.结论:TGIF能抑制TGF-β1对细胞生长和细胞周期的负调控作用,多数肿瘤细胞和间质细胞能分泌TGF-β1,这些肿瘤细胞有可能利用TGIF甚至少量TGIF,抑制TGF-β对自身的生长抑制作用,从而促进肿瘤的发生、发展与转移.
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miR-126调节骨髓间充质干细胞对游离皮瓣组织学活性的作用
背景:miRNA具有组织特异性及细胞特异性,其中内皮细胞特异性高表达miRNA-126(miR-126)在血管新生中具有举足轻重的作用。
目的:研究miR-126调节游离皮瓣移植后皮瓣成活以及组织学活性的影响,探讨其在血管新生中的作用机制。
方法:①利用瞬时转染技术提高骨髓间充质干细胞中miR-126的表达,利用Real-Time PCR检测巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1 mRNA表达及Western blot检测ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白表达;②将48只SD大鼠随机分为3组,每组16只,均制备腹部游离皮瓣模型。A-C组分别在游离皮瓣远端1 cm和3 cm处注射miR-126 mimics转染的骨髓间充质干细胞、miR-126 mimics control转染的骨髓间充质干细胞及PBS。
结果与结论:①转染miR-126 mimics后的骨髓间充质干细胞较对照组骨髓间充质干细胞中巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1 mRNA表达量分别下降36倍、3.5倍和14倍;②A组大鼠皮瓣远端组织中 ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT 的蛋白表达水平比B和C组明显增高,且pAKT/AKT及pERK1/2/ERK1/2比值高于B和C组,且皮瓣组织液中巨噬细胞炎性蛋白1α、肿瘤坏死因子α及血管细胞黏附分子1蛋白水平明显低于B和C组;③结果提示miR-126可以促进游离皮瓣组织中血管新生腺管蛋白的活化,进而促进皮瓣的成活。 -
hCAP-18/LL-37基因转染对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的影响
目的:观察人源抗菌肽hCAP-18/LL-37基因转染对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用,探讨其抗肿瘤的可能机制.方法:将含hCAP-18/LL-37的真核表达质粒瞬时转染Lewis肺癌细胞,同时设正常对照组、转染空载体组和转染重组基因组,MTT比色检测Lewis肺癌细胞转染后48和72 h的增殖活性,流式细胞术和荧光染色检测细胞凋亡.免疫细胞化学染色检测Bax、Bcl-2蛋白表达.结果:转染重组基因组Lewis细胞增殖受到明显抑制,与转染空载体组比较,转染后48和72 h的抑制率分别为3.51%和17.65%;流式细胞术检测转染重组基因组凋亡率为7.4%,正常对照组凋亡率为4.4%,转染空载体组凋亡率为5.2%;免疫细胞化学染色,转染重组基因组Lewis细胞Bax蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性(P<0.05);Bcl-2蛋白表达减少,但与对照组比较差异无显著性(P<0.05).结论:hCAP-18/LL-37基因瞬时转染Lewis肺癌细胞,可抑制肿瘤细胞牛长、调控凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达,诱导肿瘤细胞凋亡.
关键词: hCAP-18/LL-37 瞬时转染 癌 Lewis肺 细胞凋亡 -
瞬时转染后WAF1基因对肠癌细胞株Hct/8的生物学效应
目的:探讨外源基因WAF1的转染、表达活性和生物调控作用.方法:采用脂质体转染技术将外源基因WAF1转入Hct/8细胞;经免疫荧光染色和流式细胞仪分别监测外源基因的表达和对细胞分化增殖、细胞凋亡的调控作用.结果:外源基因p21WAF1/CIP1-pcDNA3在Hct/8细胞阳性表达为89.6%,显著高于空质粒对照和空白对照组(P<0.01);转染48 h后细胞分裂减慢,24~48 h凋亡指数开始增高,72 h达到高峰,以后逐渐下降.结论:克隆的外源基因WAF1具有表达活性及诱导Hct/8细胞凋亡的作用,揭示WAF1具有生物调控作用.
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幽门螺杆菌空泡毒素N端的变异分析
空泡毒素(VacA)是幽门螺杆菌(Hp)一个重要的毒力因子,口服纯化VacA可以对小鼠再感染产毒Hp菌株产生有效保护.然而,野生型VacA蛋白由于其致胃上皮细胞损伤作用而不能成为候选疫苗.尽管现在认为基因水平灭活毒力VacA蛋白可以成为合适的候选疫苗,但基因点突变是否可以将VacA细胞毒活性降低足够水平尚无定论.本文利用哺乳动物细胞瞬时转染系统研究VacA发挥致空泡化作用的小活性片段及其特征,并且对毒素功能有重要作用的区域和氨基酸残基进行突变研究.