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碱裂解法快速提取中药炒制品DNA的研究
该文旨在探索一种适用于中药炒制品DNA快速提取的方法.以氢氧化钠,1％ PVP40和1％ TritonX-100配制成碱裂解缓冲液,Tris-HCl为中和液,经加热裂解和中和2步提取不同炒制方法制备的中药炮制品的DNA,选择2种方法对DNA进行纯化,并以纯化后DNA作为模板利用通用引物进行PCR扩增.结果表明优化碱裂解法可简单快速的提取出药材DNA,槐米炒制品DNA质量浓度为(420.61±123.91) g·L-1,且使用5％ Chelex-100树脂纯化可以提高DNA提取浓度.研究结果证明优化碱裂解法适用于中药炒制品的DNA快速提取.
关键词： 中药炒制品 DNA快速提取 碱裂解法 Chelex-100 -
Blast-病毒物种鉴定的新方法
采集自愿献血员中56份HCV-Ab阳性血样,常规分离血清,应用RT-nPCR对HGV-NS3区进行核酸扩增,PCR扩增产物与PMD18-T载体连接,转染DH5d工程菌株,挑选白色菌落,经内套PCR验证克隆阳性者,以碱裂解法提取质粒DNA,应用荧光染料Big Dye标记、Sanger双脱氧末端终止法进行重组DNA的核酸序列测定.将测得的核酸序列,经国际互联网络输入到NCBI的GenBank数据库的局部序列相似形查询(Blast)的查询框中,借助于GenBank数据库中的资料和计算机分析程序中的BlastN软件,与数据库中所有已知的核酸序列进行序列同源性比对搜索分析.
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超广谱β-内酰胺酶基因分型的初步研究
按质粒所携带编码基因同源性的不同，将超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases,ESBLs)分为4类，即TEM型、SHV型、TEM/SHV混合型和非TEM/非SHV型(包括PER、TOHO、CTX-M、OXA型等)。本文报告绍兴地区产ESBLs细菌基因分型的初步结果。 临床标本分离、并经纸片扩散法确证为产ESBLs的细菌42株(其中大肠埃希菌26株，肺炎克雷伯菌16株)。用PCR进行酶基因分型。PCR扩增引物，根据TEM-1和SHV-1编码基因序列设计，TEM引物序列分别为：5′-TCGGGGAAATGTGCG-3′和5′-TGCTTAATCAGTGAGGCACC-3′；SHV引物为5′-TCGGCCTTCACTCAAGGATG-3′和5′-TCCCGCAGATAAATCACCA-3′。待测菌株用碱裂解法提取质粒DNA。PCR反应体积为100μl，含1×PCR反应缓冲液，3.5mmol/L Mg2+,200μmol/L dNTPs,500μmol/L引物，1.6U Taq酶(Promega)，10～100ng质粒DNA模板。
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血清HBV-DNA模板不同提取方法的比较和选择
目的 比较直接煮沸法、碱裂解法、浓缩碱裂解法和碱裂解3倍量提取法四种提取法提取样本核酸的差异;选择简便、可靠的检测乙肝病毒DNA(HBV-DNA)提取方法.方法 运用中山医科大学达安基因股份有限公司生产的HBV-DNA试剂盒中推荐的浓缩碱裂解法,与直接煮沸法、碱裂解法、碱裂解3倍量提取法,分别提取血清样本核酸模板,用美国MJ实时荧光定量PCR仪检测HBV-DNA,对结果进行对比分析.结果 共89例乙肝表面抗原(HBsAg)阳性患者血清,浓缩碱裂解法和碱裂解3倍量提取法检测,两者均有62例HBV-DNA阳性(＞1 000拷贝/ml定性为阳性)阳性率69.6%,阳性拷贝/ml均值用对数形式表示分别为(6.652±1.301)和(6.601±1.282),两者间结果无明显差异(P＞0.05);直接煮沸法检测出47例阳性(均在上述62例中)阳性率52.8%;碱裂解法测出57例阳性(均在上述62例中)阳性率64.0%,阳性拷贝/ml均值与浓缩碱裂解法和碱裂解3倍量提取法相比较,阳性检出率较低,有非常显著性差异(P＜0.01)和显著性差异(P＜0.05).结论 碱裂解3倍量提取法操作简单,省时、省材料,重复性好,阳性检出率与浓缩碱裂解法一致,建议使用碱裂解3倍量提取法检测HBV-DNA.
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质粒构象对转染后蛋白表达时间曲线的影响
目的 探讨质粒的不同构象下磷酸钙转染后对蛋白表达量时间曲线的影响.方法 经过处理的pcDNA3 - MADCAM -1 - Fc,pcDNA3.1/Hygro(+)- Alpha4,pcDNA3.1/Hygro(+)- Beta7三种质粒磷酸钙转染293T细胞,第一种表达分泌到胞外的蛋白通过收集上清,ProteinA纯化,另外两种表达于细胞外膜,通过流式细胞仪检测荧光强度.结果 pcDNA3 - MADCAM -1 - Fc磷酸钙转染后处理组(缺口开环)比对照组表达蛋白量多(t =5.009,p=0.0376).pcDNA3.1/Hygro(+)- Alpha4,pcDNA3.1/Hygro(+)- Beta7两种质粒共转后处理组荧光强度36h后略高于对照组,48h后对照组明显升高.结论 质粒的不同构象下磷酸钙转染后蛋白表达量有时间依赖性.
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一种制备质粒DNA的改良碱裂解法
目的介绍一种快速获取高纯度质粒DNA的方法.方法使用替代试剂,建立改良的碱裂解法进行质粒DNA提取,并用琼脂糖电泳验证所得的质粒的质量,紫外测量估算产量及纯度.限制性酶切验证其用度.结果琼脂糖电泳显示质粒DNA条带明亮,以超螺旋方式为主.A260/280为1.903,含量为320μg/mL,酶切后得到约500bp的目的片段.结论改良碱裂解法操作简单、实用,所得样品纯度高,达到了分子生物学常规实验的要求.
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应用碱裂解法研究淋病奈瑟菌质粒谱
淋病奈瑟菌(淋菌)的质粒谱(plasmid profiles)是淋菌分子流行病学研究和淋病监控的对象.本研究利用碱裂解法对2000年1月～2001年10月门诊分离的淋菌进行了质粒抽提及质粒谱分型研究.报告如下.
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心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子基因对兔缺血心肌的保护作用
目的探讨心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因对兔急性缺血心肌的保护作用.方法碱裂解法大量制备质粒;采用开胸结扎兔冠状动脉左前降支(LAD)法,建立兔急性前壁心肌梗死模型.模型制备成功后将动物分为治疗组(n=19)和对照组(n=18),并于心肌内分别注射pcDNA3-bFCGF100μg和pcDNA3 100μg,饲养至2、6、12周处死;行病理切片观察心肌梗死面积的变化和缺血心肌内血管新生的情况.
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大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
应用碱裂解法原理大量提取大肠杆菌中的质粒DNA,对质粒提取试剂盒的相关步骤进行了优化.结果显示按优化的步骤该方法提取的质粒DNA浓度高、质量好,能够符合后续酶切等常规实验的要求.
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几种miniprep提取质粒DNA方法的比较与改良
目的 比较并建立一种简单的、稳定的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值.方法 采用琼脂糖凝胶电泳对质粒DNA提取的试剂盒法、煮沸法、碱裂解法、碱裂解结合酚氯仿法四种方法进行比较.结果 试剂盒法的电泳谱带亮度高且无RNA条带,煮沸法、碱裂解法、碱裂解结合酚氯仿法的电泳谱带亮度依次增高.结论 试剂盒法制备DNA纯度高,且操作简便省时.
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一种高效的质粒DNA 少量提取的新方法
目的:介绍一种质粒DNA少量提取的新方法.方法:使用替代试剂,建立改良的碱裂解法进行质粒DNA提取,并用琼脂糖电泳验证所得的质粒的质量和产量.结果:琼脂糖电泳显示质粒DNA条带明亮,主要以超螺旋方式为主.结论:新方法操作简单、实用,达到分子生物学常规实验的要求.
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大肠杆菌质粒DNA两种提取方法比较
基因工程实验中,质粒DNA浓度、纯度和完整性直接影响着转化率,选择较好的质粒DNA提取方法非常重要,常用的质粒DNA提取方法主要有煮沸裂解法和碱裂解法[1-2].我们利用了这两种方法对同一株E.coliDH5a中质粒pUCl8进行了提取,并对提取的质粒DNA浓度、纯度和完整性以及转化进行了比较,结果报道如下:
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碱裂解法快速提取虫草属真菌DNA研究
目的 探索一种适用于虫草属基因组DNA快速提取的方法.方法 在无液氮条件下使用碱裂解法提取虫草DNA,使用ITS通用引物进行PCR扩增.考察了提取液配方、煮沸时间对DNA提取的影响以及中和剂Tris-HCl用量对PCR扩增的影响.利用优化的提取方法提取了虫草属5种虫草并用ITS通用引物进行PCR扩增.结果 80μl 0.5 mol/LNaOH进行提取,加入160μl 0.1 mol/L Tris-HCl中和,离心即可在10min内提取出虫草属真菌的DNA,PCR扩增能获得清晰目的条带.结论 优化的碱裂解法可用于虫草属DNA的快速提取.
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改进溶液Ⅱ配方可提高质粒DNA提取的质量及得率
目的 通过改进溶液Ⅱ配方,消除质粒DNA提取中的不可逆变性条带,提高质粒DNA提取的质量与得率.方法 取氨苄LB液体培养液中培养好的DH5α(pCDNA3),以NaOH系列梯度浓度/甘氨酸-NaOH缓冲液体系配制溶液Ⅱ,依据文献提供的方法 ,小量提取制备质粒DNA,以凝胶电泳、紫外分光光度计及酶切验证提取效果.结果 在NaOH浓度为0.10 mol/L下,不可逆变性条带基本得到消除,超螺旋DNA的提取纯度和得率均得到明显提高.结论 改变溶液Ⅱ的碱性条件,可以制备高质量的质粒DNA.
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碱裂解法提取质粒DNA的研究
目的对碱裂解法提取质粒DNA中主要试剂的作用进行研究.方法采用不同的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ分别进行质粒DNA的提取.结果方法3得到质粒DNA的量明显偏少,方法4得到的质粒DNA含蛋白质较多.结论溶液Ⅰ对实验结果影响不大,溶液Ⅱ中的NaOH关系到所提取质粒DNA量的多少,溶液Ⅲ中的醋酸钾是蛋白质能否去除的一个重要因素.
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川贝母基因组DNA提取方法的研究
目的 通过比较不同方法提取的基因组DNA的质量差异,选择一种可靠、简单且低成本的川贝母基因组DNA提取方法,满足药典中川贝母分子鉴别的要求.方法 采用碱裂解法、十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)、十二烷基硫酸钠法(SDS法)、改良SDS法和试剂盒法分别提取川贝母基因组DNA,经蛋白核酸分析仪检测、琼脂糖电泳分析和聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法来评价提取基因组DNA的质量.结果 除碱裂解法外,CTAB法、SDS法、改良SDS法和试剂盒法均能从川贝母中提取基因组DNA,其中改良SDS法和试剂盒法提取的基因组DNA质量相当,但是改良SDS法成本更低,操作更简单.结论 改良SDS法更适用于药典中的川贝母分子鉴别试验.
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PEG沉淀结合碱裂解法提取DNA可消除肝素对PCR检测结果的影响
乙型肝炎病毒(HBV)感染的判断主要依赖于血清特异性抗原抗体和HBV DNA定量的检测.其中外周血中HBV DNA定量是病毒复制直接和可靠的标志,对乙肝治疗效果的评价和预后也有重要的参考价值.临床上常采取全血或血浆作为检测标本,由于抗凝血液标本中可能存在着抑制PCR的因子,因此在进行PCR前需纯化血液标本中的核酸.通常认为用于PCR的全血标本通常首选乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝,不能使用肝素抗凝[1],认为肝素是Taq酶的强抑制剂,而且在其后的核酸提取步骤中很难去除[2],一些试剂厂家也明确规定"不可用肝素抗凝"[3];而我们在现实工作中经常会遇到一些血样"因误"采用了肝素抗凝容器,致使标本被退回重新采样,给实验室人员及患者带来了不便.本研究通过上述两种抗凝方法处理全血标本,采用浓缩裂解法提取DNA,观察常用肝素浓度抗凝血对实时荧光定量PCR技术检测HBV DNA的结果是否有影响.
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血清HBV-DNA模板两种提取方法的比较
目的选择提取血清HBV-DNA模板的佳实验.方法用碱裂解法、直接煮沸法两种方法提取81份血清HBV-DNA模板然后进行对比分析.结果直接煮沸法优于碱裂解法,具有方法简单易行且阳性率高于碱裂解法,两种方法结果经u检验后,具有显著性差异(P＜0.01).结论直接煮沸法提取血清HBV-DNA模板优于碱裂解法,是值得推荐的一种经济、简单、易行的实验方法.
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脂质体介导血管内皮生长因子基因促进大鼠皮瓣早期断蒂的观察
1材料与方法1.1 重组质粒的制备pcDNA血管内皮生长因子(VEGF)165(华中科技大学同济医学院杨操博士提供)含VEGF165基因片段,位于BamH I和EcoR I 2个酶切位点之间.将其转入大肠杆菌HB101感受态细胞,挑选抗氨苄西林克隆进行小量快速提取,用BamH I和EcoR I双酶切鉴定.同时送北京华大生物公司测序.将保存的大肠杆菌菌种通过碱裂解法提取大量质粒后进一步纯化.质粒经核酸蛋白微量仪(Smart SPECTM型,美国 Bio-Rad公司)检测,定量为12.5μg/μL,以等渗盐水稀释至1μg/μL备用.
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使用碱裂解法快速提取药材DNA方法的研究
目的:建立药材DNA快速提取方法.方法:使用碱裂解缓冲液提取药材DNA,考察提取液配方组成和中和剂种类对药材DNA纯度、浓度的影响.利用优化提取液提取了144个中药材DNA,动物药使用CO Ⅰ、植物药使用psbA-trnH通用引物进行PCR扩增.结果:0.5 mol·L-1氢氧化钠、1％ PVP和1％ Triton×100具有佳的DNA提取效果.对144个中药材进行PCR扩增,利用琼脂糖凝胶电泳可检测到123个中药材DNA的PCR产物.碱裂解法可用于快速提取蛇类药材DNA,并成功用于乌梢蛇、金钱白花蛇的分子鉴定.结论:优化的碱裂解法可用于提取中药材基因组DNA,其提取时间可控制在10 min左右,且避免了酚、三氯甲烷等对人体有毒试剂的使用,对药材快速分子鉴定体系的建立将发挥重要作用.
