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中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达发热伴血小板减少综合征病毒样颗粒新方法的研究
为了探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)样颗粒的高效表达方法,本研究根据布尼亚病毒装配成熟的机制,建立SFTS病毒包膜糖蛋白和核蛋白融合表达质粒,并在表达载体中引入荧光蛋白报告基因,转染中国仓鼠卵巢细胞,传代培养两代后,根据荧光蛋白表达水平,采用有限稀释法,在荧光显微镜下,人工挑选细胞集落,建立病毒样颗粒稳定表达细胞系,并通过荧光蛋白表达水平的变化,评价细胞系的稳定性,采用间接免疫荧光、免疫印迹和电子显微镜对病毒样颗粒进行分析鉴定.结果显示,融合表达的包膜糖蛋白和核蛋白可在细胞内装配形成病毒样颗粒并分泌到胞外,在无选择压力条件下筛选的细胞系能够在较长时间内保持稳定,传代40次后报告基因表达水平无明显变化.本研究显示了通过病毒结构蛋白基因的修饰,可以改进病毒样颗粒制备方法,为相关生物制品的生产技术研究提供了重要线索.
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SFTS病毒非结构蛋白重组质粒的构建及其体液免疫原性研究
目的 研究SFTS病毒(SFTS virus,SFTSV)的非结构蛋白(Nonstructural proteins,NSs)重组质粒的体液免疫原性.方法 利用聚合酶链反应法(Polymerase chain reaction,PCR)构建真核表达质粒pJW4303-NSs、pJW4303-NSs-opt、pJW4303-NSs-Flag;引入Nhe Ⅰ酶切位点及tPA(Tissue plasminogen activator,tPA)信号肽,构建质粒pJW4303-tPA-NSs-opt.将质粒转染至HEK 293T细胞,蛋白质印迹法(Western blot,WB)验证NSs表达.NSs相关质粒免疫BALB/c小鼠,采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测SFTSV NSs特异性IgG抗体.结果 成功构建了重组NSs质粒,WB验证了NSs可在HEK293T细胞内表达.pJW4303-NSs、pJW4303-NSs-opt、pJW4303-tPA-NSs-opt重组质粒均可诱导小鼠体内产生特异性IgG,其中单优化型质粒pJW4303-NSs-opt的免疫原性较好,在第6、8周的IgG水平显著高于野生型NSs质粒,差异具有统计学意义.结论 本研究构建的SFTSV的NSs重组优化型质粒具有良好体液免疫原性,其中单优化型效果佳.
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发热伴血小板减少综合征实验室检测技术应用评价研究
目的 比较不同检测技术对不同时期采集的发热伴血小板减少综合征(SFTS)病例血清标本的检测结果,观察病毒核酸、IgM抗体、IgG抗体的动态特征,为疾病的诊断方法选择提供理论依据.方法 采集SFTS疑似病例早期和确诊病例康复后血清标本,采用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测病毒特异性核酸和IgM抗体、IgG抗体,分析比较各种方法的检出结果及与采集时间的关系,观察病毒核酸及特异性抗体的动态特征.结果 87份SFTS疑似患者血清,病毒核酸阳性率为53.41％,IgM抗体阳性率为31.03％,IgG抗体阳性率为3.41％.其中55份SFTS确诊病例标本,病毒核酸和IgM抗体检测结果的一致率为36.36％,两种方法检测结果差异有统计学差异(x2 =6.82,P=0.009),kappa值=-0.257.核酸检测阳性标本采集与发病时间间隔均在12d以内,其中7～9d采集标本阳性检出率高(100％),经统计学分析,不同时间采集标本,核酸检测阳性率差异有统计学意义(x2=10.35,P=0.016).34份SFTS恢复期血标本,核酸检测均为阴性,IgM抗体阳性率为41.18％,与急性期(38.23％)比较差异无统计学意义(P=1.00).IgG抗体阳性率为94.12％,明显高于急性期IgG抗体阳性率(0％).IgM和IgG抗体动态特征观察发现,IgM抗体在发病第2天即可检出,晚检出时间为发病后第74天,30～60 d时间组吸光度均值和抗体检出率高.IgG抗体早检出时间为发病后第12天,晚检出时间为发病后100 d.30 d内采集标本IgG抗体检出率仅为2.78％,30～ 60 d时间组IgG抗体检出率为100％.结论 发病2周内采集的SFTS疑似患者血标本,可优先考虑使用实时荧光PCR方法等检测病毒核酸或检测IgM抗体.IgM抗体虽可在发病2d后检出,但检出高峰出现时间多较晚,因此检测阴性并不能排除诊断.IgG抗体在恢复期标本中阳转率高,可作为疾病诊断的辅助手段.
