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基因Ⅰ、Ⅳ型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用
设计针对国内流行的戊型肝炎病毒(HEV)基因Ⅰ、Ⅳ型,在这两型序列的保守区域设计了一套RT-PCR引物--E引物,并将E引物与目前较常用的3对通用引物(Meng、ConORF1和ConORF2引物)比较了检测基因Ⅰ、Ⅳ型HEV的灵敏度.对基因Ⅰ型HEV,E引物能检出的稀释度为105,参考引物能检出的稀释度为102～104;对基因Ⅳ型HEV,E引物能检出的稀释度为102,参考引物能检出的稀释度为101～102.在17份HEV-IgM阳性血清中,E引物检出5份,检出率为29.4%;参考引物只能检出1份或2份,检出率高为11.8%.E引物在33份HEV-IgM阳性的隐性感染血清中检出6份,阳性率18.2%;在79份HEV-IgM阳性的临床肝炎血清中检出36份,阳性率45.6%.以上结果初步表明,对于在国内流行的基因Ⅰ、Ⅳ型HEV,E引物的检测灵敏度要高于目前常用的通用引物.
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在MDCK细胞上高产的乙型流行性感冒病毒株的筛选及其全基因组克隆
流行性感冒(流感)病毒可引起世界范围的大流行,因此需要及时地生产流感疫苗来预防流感的流行.乙型流感病毒是疫苗的重要组成部分.传统制备疫苗的方法是使用鸡胚生产,存在很多缺陷,应用哺乳动物细胞生产流感疫苗是个更好的选择.但是,乙型流感病毒感染MDCK细胞后,很难得到持续的高产.此实验筛选到的乙型流感病毒在MDCK细胞连续传代15代后,PFU值从第1代的8×104到第15代2×109,TCID50从第1代6.5到第15代的8.0.将筛选到的毒株进行全基因组克隆,用两套引物获得乙型流感病毒的全部8个节段.此结果为利用反向遗传技术将高产毒株与流行毒株重配,进而在哺乳动物细胞上生产基因工程流感疫苗打下基础.
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RT-PCR-RFLP在大麦黄矮病毒检测中的应用
黄症病毒属(Luteovirus)包括大麦黄矮病毒(BYDV)Ⅰ组病毒3种、Ⅱ组病毒13种和暂定名病毒14种.早期BYDVs的鉴定与分类是根据蚜虫传毒专化性、寄主范围、组织病理学和交互保护进行的.随着高效价抗血清的获得和分子技术的发展,病毒的血清学特性、RT-PCR、核酸杂交和序列比较等手段逐渐用于BYDVs的分类,并用于研究黄症病毒组各成员间的关系.1991年,Robertson等根据当时积累的Luteovirus序列资料,首次设计合成了Luteovirus通用引物,并在BYDVs中建立了RT-PCR-RFLP技术体系[1].随后,大量Luteovirus成员的基因组全序列和外壳蛋白基因序列得到了测定[2-6].这些序列资料的进一步积累,使得原先设计的Luteovirus通用引物的适用性受到了挑战.为此,本研究重新对这些序列资料进行了收集和分析,改进合成了新的Luteovirus通用引物,并以此为基础,在BYDVs中建立了RT-PCR-RFLP实验方法.
关键词： 大麦黄矮病毒(BYDVs) 通用引物 RT-PCR-RFLP -
通用引物单链构象多态性技术检测呼吸道常见病原菌的研究
目的 探讨通用引物单链构象多态性技术用于呼吸道常见病原菌检测的可行性. 方法 选取7种常见呼吸道感染细菌,采用通用引物对细菌的16SrRNA基因进行扩增,对扩增产物进行单链构象多态性分析. 结果 经过扩增,7种常见病原菌均在300 bp处有清晰条带,扩增产物的单链构象多态性图谱条带数为2～4条,相对迁移率及条带间距也存在明显不同,各细菌间可相互区分. 结论 通用引物SSCP技术能快速简便地鉴定呼吸道常见病原菌.
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通用引物PCR扩增创伤感染细菌16S-23S rDNA间区的研究
目的 探讨通用引物PCR扩增多种创伤感染细菌16S-23S rDNA间区的可行性,为开展常见创伤感染细菌基因诊断做好准备.方法 以细菌16S-23S rDNA间区为靶序列,在16S rDNA 3'端与23S rDNA 5'端保守区自行设计通用引物,筛选5种常见创伤感染细菌,提取其基因组DNA并进行PCR扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序.结果 5种细菌基因组DNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱与预期一致,经测序比对后得到了证实.结论 该通用引物可以实现对多种创伤感染细菌16S-23S rDNA间区进行PCR扩增,为下一步进行基因诊断打下了坚实的基础.
关键词： 通用引物 PCR 创伤感染细菌 16S-23S rDNA间区 -
采用通用引物PCR与机器码识别技术快速鉴定血液感染病原菌
目的 建立一种快速检测血液感染病原菌的方法.方法 选取7种常见血液感染病原菌,在其16S rRNA末端和23S rRNA始端的保守区设计通用引物,对16S-23S rRNA基因间区进行扩增,然后将PCR产物的电泳图谱进行机器码识别,以鉴定病原菌.结果 通用引物能扩增出7种病原菌,且每种菌具有不同片段长度(bp):大肠埃希菌(716、808),金黄色葡萄球菌(732、827),铜绿假单胞菌(833),表皮葡萄球菌(630、722、817),肺炎链球菌(606),肺炎克雷伯菌(550、705、797),粪肠球菌(591、693);此图谱可经机器码识别,对各种病原菌进行快速鉴定.结论 采用通用引物PCR和机器码识别技术可简便、快速、特异地鉴定常见血液感染病原菌.
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利用荧光标记的通用引物检测基因芯片的制备质量
[目的]报告一种新的基因芯片质量控制方法.[方法]采用限制性显示技术制备一种两端具有1段特异通用引物互补序列的探针,分别以不同浓度梯度的荧光标记通用引物(Cy3-UP)和随机引物(Cy3-RP)与芯片杂交,比较两者杂交效率.[结果]Cy3-UP的杂交结果显著优于Cy3-RP的杂交结果,在较低浓度就可显示较强的荧光信号.[结论]这种新的基因芯片质量控制方法具有较好的敏感性和特异性,可以用于基因芯片的质量控制.
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采用通用引物PCR及RFLP快速检测下呼吸道感染常见病原菌的临床研究
目的 采用聚合酶链反应(PCR)配合限制性酶切片段多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析检测下呼吸道感染的常见病原菌,探讨其在临床快速诊断细菌感染中的应用价值.方法 在下呼吸道感染的住院患者中筛选出合格痰标本125例,分为2份,1份行痰培养作为对照,另1份以16S rRNA基因为靶序列,在其保守区建立通用引物进行PCR扩增,再分别用限制性内切酶HaeⅢ、MnlⅠ、AluⅠ、DdeⅠ和BstBⅠ酶切,进一步行RFLP分析,根据下呼吸道常见病原菌建立的特异酶切图谱诊断鉴定细菌,比较两种方法的检测结果.结果 125例合格痰标本中,PCR配合RFLP检测阳性85例,阳性率为68.0%,痰培养阳性72例,阳性率为57.6%,前者明显高于痰培养(P<0.01),其中肺炎链球菌及流感嗜血杆菌阳性率明显高于痰培养,部分革兰阴性杆菌阳性率也高于培养组,但部分革兰阳性球菌(溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌及屎肠球菌)阳性率较培养组低于痰培养.结论 PCR配合RFLP分析方法检测下呼吸道感染病原菌较常规培养方法敏感快捷,是一种具有临床应用价值的快速诊断方法.
关键词： 下呼吸道感染 通用引物 聚合酶链反应 限制性酶切片段多态性 16S rRNA基因 -
从粪便样品中检测动物冠状病毒的分子技术研究
目的感染冠状病毒的动物向环境排毒主要是通过粪便,建立直接从粪便样品对动物冠状病毒进行检测的分子技术具有重要的公共卫生学意义.方法通过计算机模拟和实验方法对已报道的2对针对冠状病毒pol基因的通用引物的通用性进行了验证.不经传统的病毒分离,直接从环境样品中提取病毒RNA,通过一步法RT-PCR进行检测,并通过分子杂交和Nested PCR扩增结合TaqMan探针实时荧光检测的PCR技术,提高对冠状病毒检测的灵敏度和准确度,并对猪、禽冠状病毒感染的临床样品进行分析检测.结果2对引物可以覆盖所有已知的冠状病毒,包括SARS,RT-PCR产物通过测序可以确定冠状病毒种类;实时荧光定量Nested PCR有很高的灵敏度,可以灵敏地检出所有供试的阳性样品,而荧光增量实时监测可以排除凝胶电泳检查的假阳性.结论该研究为从环境中普查和鉴定冠状病毒提供了可靠的技术方法.
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聚合酶链反应检测真菌感染的临床评价
用聚合酶链反应(PCR)检测真菌,已有较多报道[1-2],我们也曾报道过初步研究[3].为给临床提供快速、灵敏、非创伤的真菌感染诊断方法,本文就采用真菌通用引物PCR检测真菌DNA的灵敏度、特异性、可检测真菌范围及临床适用性作进一步评价.
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功能基因在皮肤微生物群落分析中的应用
使用16S rRNA基因可变区分析皮肤微生物群落时存在一定的不足,需要开发一些功能基因引物对其进行补充.在分析皮肤微生物群落中细菌的优势种属的基础上,设计并筛选了3对扩增功能基因的引物,并将之应用于较大规模样本的皮肤微生物群落特征分析中.新设计的引物不仅能够将细菌准确地鉴定到种这一层级,而且也能实现对不同样品间的微生物群落结构特征进行比较.新设计的引物在皮肤微生物群落的分析中取得了较好的效果,有较好的应用前景.
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大鼠短间隔连续部分肝切除后ADAMs mRNA表达分析
目的说明ADAMs(adisintegrin and metalloproteinase)在肝再生的不同阶段表达不同.方法用RT-PCR方法和ADAMs通用引物对本实验建立的大鼠短间隔连续部分肝切除(short interval successive partial hepatectomy,SISPH)模型0、4、8、12 hr,0、36、72、108、144 hr及0、4、40、76、112 hr肝再生过程中的mRNA进行分析.结果正常大鼠和SISPH后大鼠肝脏均存在ADAMs的表达、但表达强度不同.结论本组资料显示ADAMs可能对肝再生过程具有调控作用
关键词： ADAMs间隔连续部分肝切除 通用引物 RT-PCR 肝再生 -
一种新型通用引物多重PCR技术可特异性检测Y染色体序列标签位点?
目的：建立通用引物多重PCR(UP-M-PCR)技术,检测 Y染色体微缺失。方法：选取50例健康男性,针对Y染色体AZFa,AZFb,AZFc和AZFd区15个标签位点(STS),选择15对特异性引物和1对UP,将UP加在特异性引物对的5’端,按扩增片段大小组建4组稳定可靠的 UP-M-PCR 体系,分析其扩增效率和特异性。结果：UP引入M-PCR对检测体系无影响。UP-M-PCR可特异性扩增AZF区15个STS,且较M-PCR特异性更好,条带更清晰。结论：UP-M-PCR 体系较 M-PCR 操作方便,扩增效率均衡,特异性高,是男性不育患者 Y 染色体微缺失筛查的新方法。
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通用引物SPF1/GP6++与SPF1/GP6+聚合酶链式反应检测多型别人乳头瘤病毒敏感度的比较
目的 对比通用引物SPF1/GP6++与SPF1/GP6+ PCR两种方法检测人乳头瘤病毒(HPV)的敏感度和感染型别范围.方法 以包含HPV16全长DNA序列的质粒为模板,应用HPV L1基因型别特异性引物进行PCR扩增,获得15种型别HPV模拟靶基因序列并克隆入pEASY-T1载体,将梯度稀释的重组质粒掺入50 ng正常人基因组DNA,模拟各型别HPV感染的待测样本,对比SPF 1/GP6+和SPF1/GP6++两组通用引物的检测敏感度.进一步在68例人宫颈癌组织DNA样本中进行对比验证.结果 与SPF1/GP6+PCR比较,SPF 1/GP6++ PCR对HPV11,31,34,39,51,52,53,56,58,61和66型别的检测敏感度提高了1到2个数量级,对于HPV16,18,33和35常见感染型别的检测敏感度相似.应用SPF 1/GP6++ PCR检测宫颈癌组织HPV感染的总阳性率为98.5％(67/68),检测到11例双重感染和2例三重感染;而应用SPF1/GP6+ PCR检测的总阳性率为95.6％(65/68),仅检测到7例双重感染.结论 在SPF1/GP6+ PCR基础上建立了SPF1/GP6++ PCR方法,并证实SPF1/GP6++ PCR具有更高的检测敏感度和更广的HPV型别检测范围.
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应用通用引物 PCR 检测诊断细菌和真菌性中枢神经系统感染的价值
目的：了解细菌和真菌性中枢神经系统（CNS）感染病原谱，并探讨通用引物聚合酶链反应（PCR）检测技术的病原学诊断价值。方法收集某院2009年1月—2015年3月疑似或确诊 CNS 细菌或真菌性感染患者资料，分析其脑脊液培养病原菌种类，采用细菌16S rRNA 和真菌28S rRNA 通用引物对患者脑脊液 DNA 进行 PCR扩增和序列测定，并与同期脑脊液培养及鉴定结果进行比较。结果共收集确诊或疑似 CNS 细菌或真菌感染者400例，其中脑脊液培养阳性132例。共分离病原菌150株，其中革兰阳性菌48株，革兰阴性菌90株，真菌12株；居前3位的细菌为鲍曼不动杆菌（32株）、凝固酶阴性葡萄球菌（16株）和肺炎克雷伯菌（13株）；常见真菌为新生隐球菌（8株）。选取88份感染患者脑脊液标本和20例非感染患者脑脊液进行 PCR 扩增，PCR 扩增法灵敏度（35．23％，31／88）高于培养法（28．41％，25／88）（χ2＝4．17，P ＜0．05）。PCR 扩增和培养法阴性预测值分别为25．97％、24．10％，两种方法的特异度、阳性预测值均为100．00％。PCR 扩增测序与培养结果符合率为84．00％（21／25）；PCR 检测平均报告时间（48 h）较培养结果报告时间（细菌平均约72 h，真菌平均约96 h）更快速。结论 CNS 感染病原分布广泛，以革兰阴性菌为主；通用引物 PCR 检测具有快速、灵敏、准确等特点，具有良好的临床推广和应用价值。
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16SrRNA基因聚合酶链反应快速检测烧伤脓毒症细菌病原体的研究
目的 为早期诊断烧伤脓毒症,探索一种能迅速检测细菌感染的方法.方法 按标准收集可疑脓毒症患者39人外周静脉血标本共41份.将每份标本一分为二分别行血培养和用细菌通用引物行16SrRNA基因聚合酶链反应检测,用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,比较两种方法在检测细菌病原体时的快速性和敏感性,分析血培养及药敏结果.结果 16SrRNA基因PCR方法的阳性率(41.16%)是血培养阳性率(21.95%)的近两倍,P＜0.05.16SrRNA基因PCR方法出结果需4、5h,血培养需12～24h(多数需2、3d).9例血培养阳性患者中,8例为单一铜绿假单孢菌感染,1例为单一溶血链球菌感染.结论 16S rRNA基因PCR检测细菌感染的方法具有特异性、快速性、敏感性的优点.在该中心,使用抗生素治疗后,引起脓毒症的细菌主要为铜绿假单孢菌,该菌对目前常用广谱抗生素耐药.
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应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒
目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛.特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染.方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测.结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P＞0.05).病例总阳性数64例,阳性率38.8%.结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率.
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通用引物PCR法在人乳头瘤病毒基因检测中的应用
目的 建立通用引物PCR法检测人乳头瘤病毒(HPV)基因,探讨其在临床辅助诊断中的应用价值.方法 收集400份标本,其中男性119份,女性281份.标本均使用通用引物对MY11/09扩增HPV L1基因片段.同时扩增β球蛋白(β-globin)基因作为内对照.结果 400份标本中,72份标本HPV L1基因阳性,阳性率为20.5%.20～岁组男女HPV的检出率高.患有性病(淋病、尖锐湿疣)、不孕症、宫颈炎、非淋菌性阴道炎等疾病的女性,HPV L1基因的检出率分别为75.0%、25.0%、21.4%、19.1%.男性性病(淋病、尖锐湿疣)、前列腺炎、非淋菌性尿道炎、不育症患者的HPV L1基因检出率分别为66.7%、16.7%、13.6%、5.7%.结论 HPV L1基因的检出率较高.通用引物PCR法在临床检验中具有较高的敏感性和特异性.
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通用引物PCR法在人乳头瘤病毒基因检测中的应用
目的 建立通用引物PCR法检测人乳头瘤病毒(HPV)基因的方法,探讨其在临床辅助诊断中的应用.方法 收集787份标本,其中来自男性160份,女性标本627份.标本均使用通用引物对MY11/09扩增HPVL1基因片段.同时扩增β球蛋白(β-globin)基因作为内对照.结果 787份标本中,191份标本HPVL1基因阳性,阳性率为24.3%.男性20～岁组HPV的检出率高,女性30～岁组HPV的检出率高,但均无年龄上的显著性差异.患有性病(淋病、尖锐湿疣)、不孕症、宫颈炎、非淋菌性阴道炎等疾病的女性,HPVL1基因的检出率分别为83.3%、20.9%、22.7%、28.0%.男性性病(淋病、尖锐湿疣)、前列腺炎、非淋菌性尿道炎、不育症患者的HPVL1基因检出率分别为42.9%、18.9%、12.5%、7.8%.结论 HPVL1基因的检出率较高.通用引物PCR法在临床检验中具有较高的敏感性和特异性.
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23S rRNA通用引物的设计及在气性坏疽快速检测中的应用
目的 设计23S rRNA通用引物并将其用于气性坏疽快速检测基因芯片.方法 (1)设计23S rRNA通用引物,并对气性坏疽的主要致病菌进行聚合酶链反应(PCR)扩增.(2)对外伤感染中常见其他微生物进行检测.(3)测定该通用引物PCR的灵敏度.结果 (1)设计出1对23S rRNA通用引物,该通用引物对气性坏疽主要病原菌都能进行扩增.(2)该通用引物PCR对外伤感染中常见非梭菌微生物都不扩增.(3)该通用引物PCR的高灵敏度为1×103 cfu/mL(产气荚膜梭菌).结论 设计出了1对23S rRNA通用引物,能够满足气性坏疽快速检测基因芯片的要求.
