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重组HIV-1 gp120 AAV2/1在小鼠和恒河猴体内的免疫原性
本文旨在研究表达HIV-1中国流行株gp120基因的重组腺相关病毒疫苗在小鼠和恒河猴体内的免疫原性.用rAAV2/1-gp120免疫BALB/c小鼠和恒河猴,分别用ELISA和HIV-1假病毒中和试验检测免疫动物血清中HIV-1特异性IgG抗体水平和中和抗体水平,用ELISPOT方法和体内杀伤实验检测HIV-1特异性细胞免疫应答水平.结果显示在小鼠体内用rAAV2/1-gp120仅免疫一次就能诱导较高水平的IgG抗体.IgG抗体至少能持续21周,但没有检测到中和抗体.rAAV2/1-gp120在小鼠体内诱导微弱水平的HIV-1特异性细胞免疫应答.rAAV2/1-gp120在恒河猴体内诱导的HIV-1特异性细胞和抗体反应均很弱,且检测不到中和抗体.提示rAAV2/1载体在诱导抗体反应方面具有特殊优势,但若希望诱导HIV-1特异性中和抗体,则需要改造env基因以提高其免疫原性.
关键词： HIV-1 包膜糖蛋白Gp120 重组腺相关病毒 免疫原性 -
AAV介导的H7N9单克隆抗体在体内高效表达
2013年, 我国安徽、上海两地暴发了甲型流感病毒H7N9感染, 造成了巨大的生命财产损失.至今仍无可用H7N9疫苗上市.近来, 研究人员鉴定了多株H7N9中和抗体.但由于抗体在体内半衰期较短, 限制了其作为长效预防手段控制H7N9感染的作用.AAV (Adeno-associated virus) 作为基因治疗载体, 具有低免疫原性的特征, 并可介导外源基因在体内长期稳定表达.本实验中, 我们利用重组AAV介导H7N9的两种单克隆中和抗体HNIgGD5和HNIgGH8在体内长期高水平表达以预防H7N9的感染.结果显示, 我们所构建的重组AAV-抗体表达系统可以在细胞水平和实验动物体内介导病毒中和抗体高水平表达.其中在小鼠体内HNIgGD5表达量达到199.9μg/mL, HNIgGH8高达430.9μg/mL.这将为利用中和抗体预防H7N9感染提供新策略.尤其是对于疫苗非适用人群, 如免疫缺陷患者、老人、儿童和孕妇等预防流感入侵具有重要意义.
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小鼠次级淋巴组织趋化因子成熟肽基因/腺相关病毒重组载体的构建
目的构建含小鼠次级淋巴组织趋化因子(SLC)cDNA的重组腺相关病毒载体. 方法以C57BL/6J小鼠的淋巴组织为材料抽提总RNA,用RT-PCR方法克隆小鼠SLC的成熟肽基因.PCR产物回收后经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,插入pAAV-IRES-hrGFP质粒,用磷酸钙法,与pAAV-RC和pHelper三者共同转染HEK293细胞,包装成重组的病毒颗粒,并通过绿色荧光蛋白(GFP)报告基因荧光检测及抽提病毒DNA,进行PCR扩增等进一步证实重组病毒的形成. 结果约500?bp的小鼠SLC成熟肽基因被成功克隆,序列分析表明,所克隆的SLC基因与基因库注册的相同,重组载体的酶切及测序鉴定表明SLC基因被定向插入.重组载体转染HEK293细胞,经荧光显微镜和病毒DNA的PCR检测,证实已完成对重组病毒的包装,并表达GFP. 结论成功构建了SLC成熟肽基因重组腺相关病毒载体.
关键词： 次级淋巴组织趋化因子 RT-PCR 载体 重组腺相关病毒 小鼠 -
腺相关病毒2/1型载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究
本研究探计重组腺相关病毒2/1型(recombinant adeno-associated vires 2/1,rAAV2/1)作为载体在不同转染复数、不同时问点转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC)的效率及对其生长的影响.用含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的rAAV2/1(rAAV2/1-EGFP),以感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为1×104、1×105、1×106转染体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞,在3、7、14天时荧光显微镜下观察EGFP的表达,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况,以评估rAAV2/1对BMMSC存活、增殖、分化能力的影响.应用流式细胞仪检测rAAV2/1-EGFP对BMMSC的转染效率及荧光指数(fluorescence index number,FI).结果表明:转染24小时后即可观察到BMMSC发出的绿色荧光,荧光强弱不一,随着时间的延长,荧光的强度逐渐增强,7天后达到稳定的状态;在3、7、14天时不同MOI rAAV2/1-EGFP转染BMMSC的活力、增殖倍数、分化能力无明显变化(p>0.05);在同一感染复数时,7天比3天和14天比7天的增殖倍数显著增强(P<0.01).流式细胞仪检测显示,rAAV2/1-EGFP转染BMMSC的转染率和荧光指数随着MOI增加(1×104、1×105、1×106)和培养时间(3、7、14天)的延长而有不同程度的增加(P<0.05).结论:rAAV2/1-EGFP能有效地转染BMMSC,随转染复数的增加和短期内随转染时间的延长,转染率和荧光指数明显增加.在转染过程中rAAV2/1-EGFP对细胞的活力、生长无影响.对于改造BMMSC,rAAV2/1是一种有效的基因转移载体.
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反义白介素4重组腺相关病毒载体气道给药对哮喘大鼠的影响
目的构建携带反义IL-4基因的重组腺相关病毒(rAAV)真核表达载体,并以此干预大鼠哮喘模型,探讨其作为哮喘基因治疗方案的可行性.方法磷酸钙沉淀法将质粒pasIL4、pXX2及pXX680共转染293T细胞合成携带反义IL-4基因的重组腺相关病毒(rAAV-asIL4).Southern blot法检测合成病毒的滴度.rAAV-asIL4在动物实验开始的第1天和第14天2次通过气道给药干预哮喘大鼠(T组),实验中同时设立大鼠正常组(N组)、哮喘组(A组)以及rAAV-GFP干预组(C组).末次激发后处理大鼠,计数肺泡灌洗液(BALF)中有核细胞以及嗜酸性细胞总数,ELISA检测BALF中IL-4和IgE蛋白量,RT-PCR检测肺组织IL-4 mRNA变化,取肺组织作病理学检查.结果分析BALF中有核细胞细胞总数和Eos总数,结果表明:T组该2项指标较A组和C组有降低趋势,但这3组间差异无统计学意义(P＞O.05).BALF中IL-4、IgE的ELISA检测结果以及肺组织IL-4 mRNA RT-PCR半定量检测结果表明:T组的上述指标水平较A组和C组均明显降低(P＜0.01).T组大鼠肺组织病理学改变较A组和C组轻.结论携带反义IL-4基因的rAAV载体,对于哮喘的干预具有一定的作用.rAAV-asIL4可能具有一定临床应用前景.
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人源碱性成纤维细胞因子基因对缺血心肌血管新生的影响
目的探讨人源碱性成纤维细胞因子(hbFGF)基因对兔缺血心肌血管生成的影响.方法分别向40只新西兰兔心肌缺血模型的心肌注射1010、1012、1013v.g./Kg的携带hbFGF cDNA的腺相关病毒载体或磷酸盐缓冲液.4周后取心肌组织,采用RT-PCR检测hbFGF基因的表达;并于高倍镜下计数缺血区域新生血管数目.结果随着治疗剂量的增加,治疗各组的hbFGF mRNA表达依次增高,差异均具有显著性(P＜0.05).单个高倍视野(HPF)内的新生血管数分别为(4.52±1.37)、(10.78±1.62)和(18.64±3.32)条,而对照组为(4.46±1.42)条.高、中剂量组的新生血管计数结果显著高于对照组(P＜0.05).结论 rAAV-2载体介导的hbFGF基因能诱导缺血心肌血管生成,且呈剂量依赖性.
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人激肽释放酶基因对肾性高血压大鼠主动脉胶原含量的影响及其机制探讨
目的 观察重组腺相关病毒介导人激肽释放酶基因对肾性高血压大鼠主动脉胶原含量的影响及其可能的机制. 方法 将人组织型激肽释放酶基因(HK)克隆入重组腺相关病毒载体(rAAV)中,经三质粒共转染方法在HEK293细胞中包装成rAAV-HK病毒.雄性Wistar大鼠24只,随机分为假手术和模型组,采用5/6肾切除的方法构建肾性高血压大鼠模型.模型组大鼠再随机分成单纯手术(n=6)、对照组(n=6)和实验组(n=6).实验组大鼠单次尾静脉注射1×1011pfU的rAAV-HK病毒.分别于模型构建前、后(基因转染前)及基因转染后1～3月测大鼠尾动脉血压.基因转染3月后处死动物,取其心脏、主动脉和肾脏等脏器提取总RNA及蛋白质.主动脉组织切片行天狼星红染色,Western Blot检测主动脉组织缓激肽B2和血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)蛋白表达水平. 结果 HK基因转染后3月,实验组大鼠与单纯手术和对照组相比血压明显下降[(163±13)vs(217±16)vs(220±13)mmHg,n=6,P＜0.01];主动脉中膜内胶原纤维明显减少;主动脉组织缓激肽B2受体蛋白表达水平明显上调;AT1R蛋白表达水平则明显下调. 结论 重组腺相关病毒介导人激肽释放酶基因能够明显降低肾性高血压大鼠血压,同时减少主动脉中膜胶原纤维含量,其机制可能与它上调缓激肽B2受体和下调AT1R蛋白在主动脉组织的表达水平有关.
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rAAV-AFP转染人外周血单核细胞来源树突状细胞增强免疫刺激功能
目的:探讨表达甲胎蛋白抗原的重组腺相关病毒rAAV-AFP转染对人外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)免疫刺激功能的影响.方法:用rAAV-AFP转染新分离的DC;苔盼蓝拒染法检测每天的活细胞比率;流式细胞仪检测DC表面分子CD80,CD86,CD83,CD40,CD1a,HLA-DR及AFP的表达;并用3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激自体淋巴细胞增殖能力;MTT法检测DC诱导T细胞的杀伤活性.结果:成熟DC 77.7%表达AFP蛋白;转染对活细胞百分率和成熟DC表型无影响,与未转染组无显著差异(P＞0.05);转染后DC仍保持较强的刺激自体淋巴细胞增殖的能力,与未转染组也无显著性差异(P＞0.05),并且可诱导出特异性杀伤,效应细胞和靶细胞为80:1,40:1,20:1时,与未转染组相比均有显著差异(35.5±5.5vs 20.6±4.7;28.7±3.6 vs 15.3±2.5;16.2±2.8vs 9.6±1.8;均P＜0.01).结论:rAAV可负载AFP基因在DC中表达,rAAV-AFP转染DC对其功能无明显影响,免疫功能更强.
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重组腺相关病毒介导的细胞色素P450表氧化酶基因对TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞炎症的影响
目的研究过度表达细胞色素P450表氧化酶基因引起内源性EETs产生增加是否能抑制由TNF-α诱导的内皮炎症.方法以携带三种不同表氧化酶基因的重组腺相关病毒rAAV-CYP2C11、rAAV-CYP2J2和rAAV-CYPF87V转染人脐静脉内皮细胞,然后再以TNF-α干预,来研究它们对内皮VCAM-1的表达及外周血单核细胞PBMC与内皮细胞粘附的影响.结果 TNF-α诱导了HUVEC中VCAM-1蛋白质的表达,rAAV-CYP2C11、rAAV-CYP2J2能明显抑制TNF-α的这一作用.TNF-α诱导了PBMC与HUVEC的粘附(100±0.0%vs 620.1±65.3%),rAAV-CYP2C11、rAAV-CYP2J2能明显抑制TNF-α的这一作用(分别为120.3±33.4%vs 387.7±27.4%,131.0±28.7%vs535.0±69.7%).结论 CYP2C11和CYP2J2基因具有显著的保护内皮细胞、对抗炎症介质介导的内皮损伤的作用.
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rAAV2-TGFβ3对肝纤维化大鼠肝脏组织胶原降解的影响
目的 通过重组2型腺相关病毒(rAAV2)和基因转导,探讨转化生长因子β3(TGFβ3)对肝纤维化大鼠肝脏组织MMP-9、MMP-2、TIMP-1和Ⅰ型胶原表达的影响.方法 将实验大鼠随机分为正常对照组、模型组、阴性对照组和TGFβ3,干预组.用40%的四氯化碳(CCl4)复制大鼠肝纤维化模型.在CCl4诱导前1周,将rAAV2-TGFβ3注入大鼠尾静脉.造模8周后处死大鼠,取肝脏组织做HE染色观察肝脏组织学改变;免疫组织化学染色观察MMP-9、MMP-2、TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达,并对其阳性面积比进行半定量分析.结果 TGFβ3干预组与模型组和阴性对照组比较,肝脏组织炎性浸润明显减轻,纤维间隔增生减少,MMP-9的表达明显增加(q=23.664、27.746,P值均<0.01),Ⅰ型胶原(q=5.503、5.251,P值均<0.01)和TIMP-1(q=5.800、8.608,P值均<0.01)的表达明显下降,但MMP-2表达的差异无统计学意义(q=2.108、0.996,P值均>0.05).结论 rAAV2-TGFβ3可通过抑制大鼠肝脏组织内TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达,促进MMP-9的表达,增加胶原纤维的降解,减轻肝脏组织学损伤和纤维化程度.
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重组腺相关病毒介导的特异性发夹状RNA敲低EB病毒潜伏膜蛋白1表达对鼻咽癌细胞转移的影响
目的 探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对鼻咽癌细胞在体内增殖和转移能力的影响及其可能的机制.方法 构建重组腺相关病毒(Raav)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和Raav-shRNA-LMP-1载体.以不同滴度的Raav-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞,确定佳转染复数(MOI).Raav-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定抑制效率.将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下建立鼻咽痛移植瘤模型,观察裸鼠的肝脏成瘤及肝脏、肺脏转移情况.采用免疫组化法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达,分析LMP-1基因沉默对鼻咽癌细胞成瘤和转移能力的影响及机制.结果 Raav-EGFP以5×104病毒基因组数/细胞转染C666-1细胞,转染效率>95%.Raav-shRNA-LMP-1以5×104病毒基因组数/细胞转染C666-1后,LMP-1的表达抑制率>90%.Raav-shRNA-LMP-1转染组裸鼠的肝脏成瘤体积为(0.2527±0.1152)cm3,与Raav-EGFP转染组[(0.2533±0.0754)cm3]的差异无统计学意义(P>0.05),但Raav-sbRNA-LMP-1转染组裸鼠的肝转移率(50.0%)和肺转移率(33.3%)明显低于Raav-EGFP转染组(均P<0.05).Raav-shRNA-LMP-1转染组裸鼠的生存时间为(15.50±2.47)d,明显长于Raav-EGFP转染组[(11.50±1.22)d,P<0.05].免疫组化染色结果 显示,LMP-1抑制后,MMP-9的表达明显下调.结论 通过Raav介导RNA干扰序列能有效抑制LMP-1的表达,其可能通过下调MMP-9的表达抑制鼻咽癌细胞的转移,但对鼻咽癌细胞的生长无显著影响.
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碱烧伤后抑制角膜新生血管的实验研究--血管内皮生长因子165反义RNA的作用
目的研究重组腺相关病毒介导的血管内皮生长因子165反义RNA(rAAN-aVEGF165)抑制碱烧伤后角膜新生血管的作用.方法30只SD大鼠随机分成2组,每组15只.实验组前房注射rAAV-aVEGF165,对照组前房注射rAAV-Lacz.30天后,碱烧伤诱导角膜新生血管,以形态学分析评价角膜新生血管的情况,Weste blot评价角膜VEGF的表达.结果形态学分析显示实验组角膜新生血管得到抑制,Western blot结果显示,碱烧伤后各个时期角膜VEGF165的表达实验组明显低于对照组.结论下调VEGF能有效抑制角膜新生血管的形成,重组腺相关病毒是眼反义基因治疗的有效载体.
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重组腺相关病毒载体中残余HEK293细胞蛋白含量检测方法的建立
目的 建立一个可靠的、可供临床应用检测的rAAV2-KAL残余HEK293细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)的测试方法.方法 Western blot方法鉴定rAAV,ELISA方法确定佳线性范围及低检测限,验证准确度及精密度.本实验连续生产并用二次氯化铯纯化3批rAAV2-KAL,使用ELISA方法检测rAAV2-KAL所含有的HCP含量,验证超速离心纯化工艺中的适用性.结果 建立的ELSA方法的佳线性范围为4～200ng.mL-1,低检测为4 ng·mL-1;不同浓度的HEK293细胞蛋白抗原回收率77.0％ ～ 115.0％,准确度较好;变异系数为8.2％～15.4％均低于20％,显示准确度和精密度均良好;制备的3批rAAV2-KAL经过二次CsCl纯化后,HCP含量均低于100ng·mL-1,显示该纯化工艺可有效去除HCP.结论 本实验成功建立HEK293细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于rAAV病毒载体中HEK293宿主细胞蛋白残余含量的检测.
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Dll4基因靶向RNAi重组腺相关病毒载体的构建和高滴度病毒制备
目的:构建一个表达肿瘤血管生成调节基因Delta-like ligand 4(DⅡ4)小干扰RNA的重组腺相关病毒载体,制备靶向性抑制DⅡ4表达的高滴度重组腺相关病毒.方法:将包含肿瘤血管生成调节基因DⅡ4特异性小干扰RNA片段的质粒用EcoRI+SalI双酶切,回收目的片段,将pSNAV2.0质粒用EcoRI+SalI双酶切后同目的片段连接,脂质体法转染BHK-21细胞,G418筛选后以辅助病毒感染获取病毒.结果:PCR和测序证实,成功构建包含U6启动子和肿瘤血管生成调节基因DⅡ4特异性RNA干扰片段的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为2.4×1011vectorgenome/L高滴度腺相关病毒.结论:成功构建携带DⅡ4基因短发夹状干扰RNA的腺相关病毒载体.为下一步探索抗肿瘤血管生成基因治疗的新途径提供实验基础.
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重组腺相关病毒载体在大鼠海马内转导特征及其细胞亲嗜性
目的 探讨3种不同血清型重组腺相关病毒(rAAV1、rAAV2和rAAV5)载体在大鼠海马内转导效率及细胞亲嗜性的差异,从而选择更加适于中枢神经系统(CNS)转基因治疗的载体.方法 雄性健康成年SD大鼠18只,随机分为3组,每组6只,分别接受立体定向注射剂量和滴度相匹配的rAAV1、rAAV2、rAAV5载体,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,于注射后8周取脑行序列冰冻切片,以荧光显微镜观察EGFP在脑内的表达情况,并以Image-Pro Plus图像处理系统自动测量表达的面积和阳性细胞数量;为确定rAAV载体在CNS中的细胞亲嗜性,以神经元核性蛋白(NeuN)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光双重标记法观察EGFP在不同类型神经细胞的表达情况.结果 各组EGFP表达呈现不同分布特征,rAAV1介导EGFP在海马CA1～CA3区绝大多数锥体细胞及齿状回的颗粒细胞中表达,rAAV2主要局限于齿状回门区的多形细胞层,rAAV5仅在CA1和CA2区锥体细胞层的少量细胞中表达.大嘴尾侧转导距离、大转导面积和EGFP阳性细胞计数rAAV1均显著大于rAAV2和rAAV5(P＜0.01),rAAV2和rAAV5比较,差异均无显著性(P＞0.05).免疫荧光标记显示rAAV1既可以转导神经元,又可以转导胶质细胞;而rAAV2和rAAV5则仅可转导神经元.结论 rAAV1不仅可以比rAAV2和rAAV5转导更大的范围和细胞数量,而且具有更广的组织亲嗜性,是一种高效的转基因载体.
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神经肽Y干预对海人酸致痫大鼠海马组织神经肽Y表达的影响
目的 探究神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)干预对海人酸致痫大鼠海马组织NPY表达的影响.方法 将36只雄性Wistar大鼠平均分为生理盐水组(NS组)、海人酸致痫大鼠组(KA组)、NPY干预组(NPY组),每组各12只.KA组和NPY组大鼠大脑海马CA3区注射海人酸,制作大鼠慢性癫痫模型;同时NPY组大鼠造模成功后行基因转染手术,采用立体定位仪向大鼠脑室注射10μl(滴度为5×1011μg/ml)重组腺相关病毒载体神经肽Y(recombinant adeno-associated virus vector neurpeptide Y,rAAV2/1-NPY-EGFP),向NS组大鼠海马CA3区注射等量的生理盐水.各组大鼠分别于基因转染2周和4周后,取海马组织保存于液氮中,每组每个时间点选取6只大鼠,采用免疫组织化学法检测各组大鼠NPY的表达情况.采用双盲法统计结果,应用半定量积分方法将每个时间点的大鼠CA3区NPY的阳性细胞率和阳性细胞着色强度进行分级记分,评估海马组织NPY表达阳性强度.结果 基因转染2周后,KA组和NPY组大鼠海马组织NPY阳性细胞率、阳性细胞着色强度及免疫组织化学评分(immunohistochemical score,IHS)均显著高于NS组(P<0.05),但KA组与NPY组上述指标比较均无显著差异(P>0.05).基因转染4周后,KA组大鼠海马组织NPY阳性细胞率、阳性细胞着色强度及IHS评分均显著高于NPY组和NS组,但NPY组和NS组上述指标比较均无显著差异(P>0.05).结论 癫痫发作过程中内源性NPY表达水平明显上调,NPY参与了抗癫痫的过程,外源性NPY对癫痫的发作具有抑制作用.
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重组1、2、5型腺相关病毒载体在大鼠脑的转导效率研究
目的探讨重组1、2、5型腺相关病毒(rAAV1、rAAV2和rAAV5)载体经不同途径向大鼠脑转入增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达情况和转导效率的差异,选择更加适于中枢神经系统(CNS)转基因治疗的rAAV血清型和可行的基因转入途径.方法雄性健康成年SD大鼠54只,随机分为9组:rAAV1/2/5海马注射组、rAAV1/2/5脑室注射组、rAAV1/2/5皮层注射组,每组6只.每组立体定向注射剂量和滴度相匹配的rAAV1-EGFP、rAAV2-EGFP和rAAV5-EGFP,于注射后8周处死大鼠取脑,行序列冰冻切片(n＝4)并以荧光显微镜观察EGFP在脑内的表达情况,或取大脑(n＝2)行实时荧光定量PCR研究.结果荧光显微镜下观察:在海马注射组,rAAV1-EGFP在海马CA1～CA3区锥体细胞层的胞体及其突起呈强表达,而rAAV2-EGFP的阳性表达主要局限于齿状回门部的多形细胞层,rAAV5-EGFP的阳性表达仅在CA1和CA2区的少数锥体细胞呈散在分布.而在脑室和皮层注射组,仅rAAV1-EGFP可观察到EGFP表达,而rAAV2-EGFP和rAAV5-EGFP均未见表达.实时荧光定量PCR结果:在侧脑室、海马和皮层注射组中,rAAV1-EGFP、 rAAV2-EGFP 、rAAV5-EGFP载体的表达量差异均有统计学意义(均P<0.01),其中,rAAV1-EGFP的表达强,rAAV2-EGFP弱,rAAV5-EGFP介于两者之间.结论 rAAV1在大鼠脑各注射部位均可有效转导,其介导的基因表达范围和mRNA表达量均明显高于rAAV2和rAAV5,rAAV1是一种比rAAV2和rAAV5更为高效的转基因载体.
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rAAV1介导血管内皮生长因子基因表达对大鼠脑缺血新生血管形成及神经功能恢复的影响
目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因治疗对大鼠脑缺血的治疗作用及其机制.方法 成年雄性SD大鼠64只,分为对照组和治疗组,每组均32只,采用立体定向微量注射的方法将相同滴度的rAAVl-VEGF(治疗组)和rAAVl-Lacz(对照组)注入大鼠侧脑室,21 d后制作大脑中动脉区缺血再灌注(MCAO)模型,于不同时间点对各组动物进行神经损伤程度评分(NSS),以免疫定量分析法榆测各组大鼠脑组织中VEGF的表达量、以免疫组织化学染色检测脑内VEGF的表达部位和微血管密度(MVD),并行vWF和BrdU的免疫荧光双重标记,采用尾静脉注射FITC-葡聚糖法行脑微血管灌注成像,并对各组缺血半暗带区域的脑微血管灌注情况进行评估.结果 (1)治疗组的NSS评分有明显改善;(2)VEGF可在脑内多个结构表达,其VEGF表达量是对照组的27倍;(3)治疗组MVD为157±13、对照组为89±9(P<0.05),且治疗组半暗带区域可见大量BrdU阳性的内皮细胞,而对照组未见;(4)缺血半暗带区域微血管显影面积为(152 617±13 076)μm2/mm2,对照组为(91 658±6577)μm2/mm2(P<0.05).结论 rAAVI-VEGF可介导VEGF在大脑内表达,并对脑缺血大鼠神经功能的恢复具有促进作用,其治疗机制可能与VEGF促进新生血管形成并改善脑组织供血有关.
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rAAV介导的靶向HIF-1α小干扰RNA在乏氧条件下对MiaPaCa2细胞Glut-1表达的影响
目的:以重组腺相关病毒(rAAV)为载体介导以HIF-1α为靶点的小干扰RNA,在厌氧培养条件下作用于Mia-PaCa2人胰腺癌细胞,观察其对糖代谢反应关键酶--葡萄糖转运体-1(Glut-1)表达的影响.方法:构建rAAV介导的以HIF-1α为靶基因的RNA干扰表达载体,即rAAV-siHIF.将rAAV-hrGFP、rAAV-siHIF-1α分别转染对数生长的MiaPaCa2人胰腺癌细胞.在乏氧条件下进行培养,应用Real-Time PCR、RT-PCR、Western Blot法观察其对Mia-PaCa2细胞HIF-1αmRNA、蛋白以及Glut-1 mRNA、蛋白表达的影响.结果:Real-Time PCR和Western Blot检测发现.rAAV-siHIF-1α能够抑制MiaPaCa2细胞HIF-1αmRNA和蛋白的表达.RT-PCR和Western Blot检测发现,rAAV-siHIF-1α能抑制MiaPaCa2细胞Glut-1mRNA和蛋白的表达.结论:rAAV-siHIF-1α能抑制MiaPaCa2人胰腺癌细胞糖代谢关键酶Glut-1表达的作用.
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神经肽Y对海人酸致痫大鼠中NR1、NR2A受体的影响
目的 探讨重组腺相关病毒载体神经肽Y(rAAV2/1-NPY-EGF-P)干预前后海人酸致痫大鼠海马中NR1、NR2A表达的变化.方法 将36只雄性Wistar大鼠随机等分为对照组、海人酸致痫大鼠组(KA组)以及神经肽Y(NPY)干预组(NPY组)各12只.KA组和NPY组均在海马CA3区注射海人酸建立为慢性癫痫模型,造模成功后,NPY组向脑室注射10l滴度为5×1011μg·mL-1的rAAV2/1-NPY-EGFP进行基因转染,KA组不注射病毒,对照组海马CA3区注射等量的生理盐水.各组动物分别于基因转染后2w、4w,取海马保存于液氮.每组动物选取12只,每个时间点6只大鼠,用免疫组化方法检测各组NR1,NR2A的表达情况.对试验结果采用双盲法进行统计,应用半定量积分的方法,把每个时间点的大鼠CA3区NPY的阳性细胞率和阳性细胞着色强度进行分级记分,后依据两项之积计算其阳性强度(IHS).结果 2w及4w时KA组和NPY组NR1、NR2A阳性细胞数量、染色强度和IHS分数均高于对照组,(P<0.05);4w时NPY组阳性细胞比例、染色强度和IHS评分均低于KA组,(P<0.05).结论表达可能参与了NPY抑制癫痫发作的发病机制.
