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乙型脑炎病毒表达载体的研究
用RT-PCR方法分段扩增了乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株5'、3'NCR,利用融合PCR技术在5'、3'NCR之间引入BamHⅠ酶切位点,将5'NCR置于T7启动子控制之下,构建乙脑病毒微复制子表达载体pMR.分别将绿色荧光蛋白(GFP)和汉滩病毒核蛋白编码区基因插入到pMR中,构建两种表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体:pMR-GFP和pMR-84FliS.经荧光显微镜直接观察、Western blot、ELISA等方法检测,证实外源基因能够在辅助病毒SA14-14-2感染的BHK-21细胞中表达.
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乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的纯化
目的 建立纯化乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的方法.方法 应用超滤浓缩和分子筛凝胶柱层析纯化乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2病毒液,检测其病毒滴度、原代地鼠肾细胞残留蛋白含量、牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量,并进行小鼠脑内致病力试验、乳鼠传代返祖试验、异常毒性试验,制备纯化冻干疫苗,进行热稳定性试验.结果 纯化后的JEV病毒滴度高于7.0 lgPFU/ml,平均回收率为23％;牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量及安全性试验均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,去除了约95％的原代地鼠肾细胞残留蛋白;制备的冻干疫苗及热稳定性试验中的病毒滴度均高于5.7 lgPFU/ml,且热稳定性试验中病毒滴度下降未超过1.0lg,符合《中国药典》三部(2010版)规定.结论 建立了乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)纯化工艺,但病毒回收率较低,不适宜规模化生产,对乙型脑炎病毒减毒活疫苗质量控制具有指导意义.
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不同年份生产的乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2基因稳定性研究
为了研究不同年份生产的乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因稳定性,从分子水平控制乙型脑炎减毒活疫苗质量,确保疫苗安全性,本研究分析了不同年份生产的乙脑活疫苗病毒E蛋白基因核苷酸序列及编码的氨基酸序列,并与该疫苗原始种子、主种子、工作种子、乙脑病毒强、弱毒株进行比较.结果显示不同年份生产的乙脑活疫苗病毒E蛋白基因核苷酸序列与其原始种子、主种子、工作种子和基因库中登录的乙脑病毒弱毒株SA14-14-2的相应序列完全一致,与乙脑病毒强毒株SA14的E蛋白氨基酸序列比较有9个位点氨基酸发生了改变.不同年份生产的乙脑活疫苗病毒E蛋白基因稳定性表明该疫苗质量稳定、安全.
