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感染性马传染性贫血病毒嵌合克隆的构建
在已有的全长感染性克隆pFD3的基础上,构建了新的低拷贝的全长克隆pLGFD3-8.按照疫苗制备过程中env基因的变化情况,采用基因替换和定点突变的方法,构建了一系列具有马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株env基因及其主要突变特征的嵌合克隆.利用这些克隆转染FDD细胞,并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性.结果发现,在FDD细胞中传代3次后,可在细胞培养物中检测到逆转录酶活性和原病毒DNA的存在,在电镜下可以观察到典型的EIAV病毒颗粒.这一结果为进一步研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和免疫保护机理奠定了良好的基础.
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β地中海贫血基因治疗进展
广义的基因治疗包括基因矫正治疗和基因调控治疗.一、基因矫正治疗是指运用DNA重组技术修复患者细胞中有缺陷的基因,使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的.它包括基因添加(gene aumentation)、基因替换(genereplacement)和基因修正(gene correction).后二者因技术难度大,有待技术上的突破,目前基因治疗的研究主要集中在基因添加(又称基因增补)方面.
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基因工程鼠模型在抑郁障碍中的研究进展
抑郁障碍是常见的精神障碍之一,因其具有高复发率、高自杀率、高致残率等特点而受到人们的广泛关注.预计到2020年,其将成为仅次于癌症的人类第2大杀手,终身患病率将＞15％,已经成为年龄＜ 45岁成年人的主要致残原因[1-2].大量的研究数据显示,该病可能是多种微效基因联合作用的结果,但是明确的致病基因目前尚不清楚,发病机制尚未明了[3].因此探讨该病的产生机制,寻求有效的药物治疗途径已经成为迫切需要解决的课题.然而,鉴于道德和伦理问题,不可能在患者身上进行过多的研究与干预.随着基因工程技术的发展,基因工程( genetic engineering)鼠模型备受医务工作者关注.其主要包括基因敲除( knockout,KO)鼠、基因替换(Knockin,KI)鼠和转基因( transgenic)鼠等.基因工程鼠模型具有较强操作性、易跟踪观察性、伦理道德问题相对较少性等优点,而且,此模型能够很好地模拟人类的情感性精神障碍,能够进行整体、分子和基因各水平的干预和科学研究[4].下面就基因工程鼠模型在抑郁障碍神经生物学、神经内分泌功能和神经电生理等方面的研究进展进行综述.
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炭疽芽胞杆菌A16D2株BA2380基因缺失突变株的构建
本课题组早期研究结果表明,炭疽芽胞杆菌BA2380蛋白可能与炭疽芽胞杆菌毒力有关,因而有必要对其功能进行深入研究.选取炭疽芽胞杆菌A16D2株为出发菌株,以其BA2380基因为目的缺失基因,参照A16D2株基因组序列及质粒pSET4s序列,利用软件设计上下游同源臂及抗性基因引物,用本实验室改造的"Golden Gate"克隆方法将3个片段同时连入温敏型穿梭载体pKMBK中(本实验室构建的受体质粒),从而构建基因打靶质粒.将该基因打靶质粒导入炭疽芽胞杆菌A16D2感受态细胞中,利用同源重组原理,筛选获得炭疽芽胞杆菌A16D2 BA2380基因缺失突变株,并对其进行验证.结果验证了本课题组构建的"Golden Gate"克隆体系进行多片段克隆的高效性,也为后续探索其基因功能奠定了基础.
关键词： 炭疽芽胞杆菌 GoldenGate克隆 基因替换 同源重组 -
072荚膜组织胞浆菌的致病性和钙依赖性
荚膜组织胞浆菌是呼吸系统真菌病病原体,在土壤中以腐生霉菌型存在,吸入肺内后,则以单细胞酵母型存在.酵母型菌能在缺钙的环境中生长,并分泌相对分子质量(Mr)为7.8×103的钙结合蛋白(CBP);而霉菌型生长需要钙,不分泌CBP.为了证实CBP在钙需求和(或)致病性关系,作者设计了一个剔除cbp1基因的策略,即利用线形端粒质粒(PTS100)和二步遗传选择法进行等位基因替换.
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基因治疗原理及发展
1 基因治疗原理1.1 基因治疗类型一般包括替换疗法及添加基因法两种类型[1].1.1.1 替换疗法是理想的基因治疗类型,即将有缺陷的基因除法,换上具有正常功能的基因,这种治疗方法称替换疗法.如异常β-珠蛋白的基因用正常β-珠蛋白的基因替换,由于必须在生殖细胞基因转移,难度大,尚未进入临床.
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大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q10合成能力的影响
目的 强化大肠杆菌合成辅酶Q10(CoQ10)的能力.方法 利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因.结果 首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍.检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍.结论 成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高.
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马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建
在已有全长感染性克隆pLGFD3-8和pD70344的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换.将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT-PCR方法及Real-time RT-PCR验证其感染性.结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性.电镜下可见大量典型的EIAV颗粒.pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8具有相似的复制水平,pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞.此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础.
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基因打靶技术及其在生物医学中的应用
一、基因打靶的概念利用细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质,以定向修饰改造染色体上某一基因的技术叫基因打靶(gene targeting).它是80年代后半期发展起来的一门按预期方式精细改造生物遗传信息的实验手段.基因打靶常用的一种策略是通过同源重组使特定靶基因失活,以研究该基因的功能,称基因敲除(gene knock-out);也可通过同源重组用一种基因替换另一种基因,以便在体内测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的,该技术叫基因敲入(gene knock-in),本文中,我们主要介绍基因敲除技术.
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皮肤基因治疗展望
基因治疗指的是在DNA水平上对异常基因进行修饰以达到纠正基因缺陷所导致的一系列病理生理的治疗.基因治疗包括基因修正、基因替换和基因增补.基因修正指的是对有缺陷的基因进
