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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒刺突蛋白基因片段的表达及其初步应用
严重急性呼吸综合征(SARS)病毒为冠状病毒科.该病毒主要引起以破坏呼吸道肺上皮细胞为主的全身性疾病,引发免疫抑制和全身感染.同时,SARS病毒感染与全身血管病变有关.目前,在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法,细胞培养的抗原面临纯化困难和操作的危险性.我们利用基因重组的方法,表达了SARS冠状病毒S1蛋白的C端部分,此区域包含主要中和抗原位点[1].利用原核表达系统快速高效的特点,可以迅速表达重要的新病原活性蛋白,为进一步建立特异性诊断方法、疫苗动物试验、中和抗体诱导、基因工程疫苗的研制提供实验手段和依据.同时也为疫苗研究提供了新的战略思路.
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中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白特征分析
目的 研究中东呼吸综合症病毒刺突蛋白的流行特点. 方法 从美国生物信息中心(NCBI)下载2012年以来流行的中东呼吸综合症病毒刺突蛋白氨基酸序列,通过生物信息学手段(多序列比对和蛋白进化树)分析中东呼吸综合症病毒刺突蛋白氨基酸序列的流行特征. 结果 1)2012年以来中东呼吸综合症病毒流行以来刺突蛋白氨基酸序列呈现出一定的地域性特点,其中来自法国的人源刺突蛋白序列之间的同源性为99.70％～100％,来自阿拉伯联合酋长国的刺突蛋白序列之间的同源性为99.63％～100％,来自2014年阿拉伯联合酋长国的刺突蛋白序列在同一进化树分枝上.2)来自沙特阿拉伯的人源刺突蛋白序列未表现出时间上的差异,2013、2014和2015年分离株刺突蛋白的同源性为99.63％～100％,但是来自沙特阿拉伯的刺突蛋白与来自法国和阿拉伯联合酋长国的刺突蛋白区别明显;在进化树上,来自沙特阿拉伯的呼吸综合症病毒刺突蛋白氨基酸序列并没有完全聚在相同的进化分枝上,而是分散在相对集中的不同分枝上.3)2014年3、5、6月来自美国的3条刺突蛋白序列之间的同源性为99.70％～99.85％低于和来自沙特阿拉伯的人源刺突蛋白之间的同源性(99.70％～100％).4)不同宿主间来源株的刺突蛋白序列之间无明显区别,其中单峰驼来源的刺突蛋白序列间的同源性为98.15％～100％,其与人源刺突蛋白序列之间的同源性为99.56％～100％,单峰驼源的刺突蛋白序列在进化树上分散在沙特阿拉伯人源刺突蛋白分枝上.5)英格兰分离株刺突蛋白之间的同源性为99.70％～99.93％,低于和分离较晚的几条源于沙特阿拉伯的人源刺突蛋白之间的同源性(100％),而与分离较早的来自沙特阿拉伯的刺突蛋白氨基酸序列(Seq36,Seq51)的同源性较低(99.78％～99.93％),且分散在不同的分枝上.6)来源于韩国分离株的一刺突蛋白与其他刺突蛋白之间的同源性高为99.78％,处于单独分支上.7)来自中国分离株的刺突蛋白序列与来自英格兰以及沙特阿拉伯部分人源刺突蛋白序列同源性为100％. 结论 地区间中东呼吸综合症病毒刺突蛋白的同源性很高,达98.15％～100％,说明刺突蛋白氨基酸序列非常保守.本次流行的中东呼吸综合症冠状病毒在同一地域内有多种不同的病毒株流行,多地可能同时存在中东呼吸综合症流行,也同时存在地区间输入性快速传播;同一地区不同年份病毒的刺突蛋白变异不明显,不同宿主间的病毒刺突蛋白序列无显著差别.
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严重急性呼吸综合征患者核壳蛋白和刺突蛋白S1区的特异性抗体研究
目的研究严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清中抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)核壳蛋白(N)及刺突蛋白(S) S1区特异性抗体的产生规律,评价这两种蛋白在SARS诊断研究中的作用.方法采用ELISA法检测86例确诊SARS患者血清中针对N和S1蛋白IgG(N-IgG和S1-IgG),并与SARS-CoV IgG水平进行比较.结果两种蛋白的特异性抗体的阳性率均随着病程的延长而增高.N-IgG在发病第1周检出阳性率为14%(6/44),第2周为56%(10/18),第3周达到100%(24/24);S1-IgG第1周检出阳性率为5%(2/44),第2周为39%(7/18),第3周阳性率达到83%(20/24).两种蛋白抗体的检测结果分别与SARS-CoV IgG结果比较,检测符合率分别为88%(76/86)和83%(71/86).结合免疫印迹和ELISA两种方法检出正常人群SARS-CoV N-IgG阳性率为1.88%(14/745).结论 SARS-CoV N和S1重组蛋白对于SARS诊断试剂的研究具有重要价值.
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SARS病毒刺突蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化
目的获得SARS病毒表面刺突蛋白片段.方法用PCR方法克隆SARS S2片段基因,并在大肠杆菌中进行表达.表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定,阴离子交换层析纯化.结果SARS病毒S2片段基因在大肠杆菌中获得了高表达,表达量占总蛋白的50%以上;得到纯度大于90%的SARS蛋白样品.结论获得了能够应用于SARS疫苗研究的SARS蛋白样品.
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抗SARS刺突蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
目的制备抗SARS病毒表面刺突蛋白单克隆抗体,用于SARS研究.方法大肠杆菌中表达的SARS-S2蛋白经纯化后免疫小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,制备单克隆抗体,并进行ELISA和Western blot鉴定.结果所制备的抗SARS病毒表面刺突蛋白单克隆抗体,能与表达的SARS-S2蛋白发生特异性结合.结论已获得了抗SARS病毒表面刺突蛋白单克隆抗体.
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严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒疫苗的研制现状
新型冠状病毒作为严重急性呼吸道综合征暴发流行的病原体(SARS-CoV),目前仍无抗SARS-CoV的特效药物,因此疫苗的研究为预防SARS再次流行具有重大意义.目前研制的SARS-CoV疫苗有SARS-CoV灭活疫苗、SARS-CoV DNA疫苗、SARS-CoV腺病毒载体疫苗、重组SARS-CoV刺突蛋白-减毒痘苗病毒等.体外及体内动物攻毒保护实验结果显示,所研制的SARS疫苗均可诱生体液和细胞免疫应答,并对免疫动物具有保护性作用.本文将近期有关研究结果作了综述.
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严重急性呼吸综合征-冠状病毒原核表达蛋白血清特异性抗体检测方法的比较
SARS冠状病毒(CoV)的主要结构蛋白包括刺突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、被膜蛋白(E)以及核壳蛋白(N)[1].N蛋白由422个氨基酸组成,在病毒体内含量丰富,是机体抗SARS-CoV免疫应答的主要靶蛋白之一[2].
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严重急性呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白在酿酒酵母中的表达和纯化
目的 构建重组表达质粒pYES6-S,诱导SARS冠状病毒刺突蛋白(spike protein)在酿酒酵母中的表达并纯化.方法 反转录获得SARS冠状病毒DNA片段,PCR法获得刺突蛋白基因互相重叠的四部分片段,酶切连接成全长,在大肠埃希菌E.coli JM109中构建重组表达克隆pYES6-S,在酿酒酵母中诱导表达并纯化.结果 重组克隆pYES6-S经酶切、测序鉴定确定,插入片段大小、方向、碱基匹配与预期一致,获得1个完整的刺突蛋白基因,表达产物纯化后,电泳鉴定,相对分子质量大小近110 000.结论 成功克隆SARS冠状病毒刺突蛋白基因全长,并在酿酒酵母中诱导表达成功,有助于抗SARS分子疫苗的研究.
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腺病毒介导SARS病毒SN基因表达及其诱导的体液免疫
目的检测重组腺病毒Ad-SN在体内外的表达,初步探讨其在大鼠内诱导的体液免疫反应.方法 Ad-SN感染Vero-E6细胞后用RT-PCR和Western Blot法检测SN基因的表达;用Western Blot法检测Ad-SN在大鼠皮下组织中的表达.Ad-SN皮下免疫大鼠,用ELISA法测定血清中抗SARS-CoV IgG水平.结果在Ad-SN感染的Vero-E6细胞中存在SN基因的转录,其mRNA量呈剂量依赖性;在Ad-SN感染的细胞、其培养上清及Ad-SN注射部位组织中均能检测到SN的表达.在Ad-SN免疫大鼠血清中可检测到高滴度SARS冠状病毒抗体(IgG).结论 Ad-SN能表达分泌型SN蛋白,并在大鼠体内诱导SARS-CoV特异的体液免疫反应.
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SARS病毒刺突蛋白与TAP标签在Vero细胞内的融合表达研究
目的:探讨SARS冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spike protein,S蛋白)与钙调蛋白结合肽(calmodulin binding peptide,CBP)-蛋白A串连亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)标签在Vero细胞内的融合表达及亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础.方法:从质粒pGEM-4Z-S中扩增S片段,在5'端加入Kozak序列,并与TAP标签基因共同插入pcDNA3.1(-)中,构建出真核表达载体pcDNA3.1-S-TAP(C).将构建好的质粒瞬时转染Vero细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光及Western-blotting技术检测融合蛋白的表达及亚细胞定位.结果:成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-S-TAP(C),瞬时转染Vero细胞后S-CBP-蛋白A融合蛋白[S-TAP(C)]得到表达,重组痘苗病毒vTF7-3可有效增强该融合蛋白的表达水平,且检测到S-TAP(C)融合蛋白表达于细胞膜上.结论:S蛋白与TAP标签融合蛋白表达于细胞膜上,且vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高,可用于S蛋白结合蛋白的筛选.
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抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定
目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb).方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定.结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应.结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础.
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蝙蝠SARS样冠状病毒S蛋白受体结合域在昆虫细胞中的表达和纯化
目的:在昆虫细胞表达系统中表达蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白的受体结合域,并探讨其表达动力学和纯化条件.方法:以PCR扩增蝙蝠SARS样冠状病毒Spike基因的受体结合域片段,产物连接到pMD-T载体,再亚克隆至供体质粒pFAST-HTB,经序列测定确认基因正确克隆,进一步将其转座入Bacmid中,在昆虫细胞Sf9中进行表达,采用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析,并通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白.结果:在昆虫细胞表达系统中表达出蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白的受体结合城片段,当感染复数( multiplicity of infectiin,MOI)为2时,重组病毒感染细胞56 h后,重组蛋白的表达量达到峰值.结论:蝙蝠SAPS样冠状病毒Spike蛋白的受体结合域片段在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达,并可通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白.
关键词： 刺突蛋白 受体结合功能域 蝙蝠SARS样冠状病毒 杆状病毒 -
携带SARS-CoV刺突蛋白N端片段重组腺病毒的构建
[目的]构建携带SARS冠状病毒刺突蛋白N端基因片段的重组腺病毒.[方法]从SARS病毒cDNA扩增刺突蛋白N端基因片段(-45～1469nt,截短的S1区,SN),插入腺病毒穿梭质粒pShuttle,通过体外连接法构建重组腺病毒Ad-SN.用Ad-SN感染Vero-E6细胞,通过RT-PCR和Western blot法检测SN的表达.[结果]克隆的SN基因序列与文献报道基本一致;Ad-SN基因组结构与预期一致.在Ad-SN感染的Vero-E6细胞中存在SN基因的转录和分泌型SN蛋白的表达.[结论]体外连接法是一种简便易行的重组腺病毒载体构建方法;重组腺病毒Ad-SN能正确表达分泌型SN蛋白,可用于诱导抗SARS免疫的动物实验研究.
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刺突蛋白亚单位基因疫苗在大鼠体内诱导的体液免疫反应
目的 利用重组腺病毒表达SARS病毒蛋白N端,研究其在动物体内诱导的体液免疫反应,探讨将其进一步开发为SARS病毒基因疫苗的可行性.方法 用截短的刺突蛋白S1亚单位(SN)腺病毒载体疫苗(Ad-SN)皮下免疫大鼠[1×107pfu/(鼠·次),每周1次,连续3周],用ELISA法测定血清中抗SARS-CoV IgG水平.结果 Ad-SN在大鼠体内能诱导产生高滴度的抗SARS冠状病毒IgGs,IgGs在免疫开始2周出现,在后一次免疫1～2周达到高(高滴度为1:28.5).用Vero-E6细胞体外攻击保护试验检测免疫动物血清中SARS病毒中和抗体发现,Ad-SN免疫鼠血清能在体外保护Vero-E6细胞免受SARS病毒攻击,中和滴度达到1:26.9.结论 Ad-SN能在大鼠体内诱导SARS病毒特异的保护性体液免疫,有望发展成为一种SARS基因疫苗.
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重组SARS-CoV刺突蛋白基因片段的原核表达及纯化
目的:冠状病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白(spike glycoprotein,S蛋白)是病毒的主要结构蛋白之一,也是重要的病毒抗原,重组S蛋白的表达可用于检测病毒感染后血清抗体.方法:根据抗原性预测分析结果,将S蛋白中抗原决定簇的编码基因重新拼接成两个新的基因,通过全基因合成方式直接合成至原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni-NTA试剂盒纯化目的蛋白.结果:SDS-PAGE证实重组S蛋白的表达,并被纯化.结论:重组刺突蛋白的表达及纯化,可做为检测SARS-CoV抗体的抗原,有助于进一步开展SARS-CoV相关研究.
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SARS冠状病毒刺突蛋白的研究进展
SARS冠状病毒S蛋白是病毒颗粒大的结构蛋白和重要的表面抗原.该蛋白在介导病毒颗粒与宿主细胞受体结合、融合的过程中起着关键作用.它是病毒中和性抗体的靶点,在疫苗研究和抗病毒治疗研究中均占有重要地位.本文就SARS流行以来有关S蛋白的研究作一综述.
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中东呼吸综合征冠状病毒的传播与防护
1中东呼吸综合征冠状病毒的传播
自发现中东呼吸综合征冠状病毒( MERS-CoV)以来,研究人员对其传播源进行多方面的调查及研究。初,推测这种病毒可能来源于蝙蝠,因为蝙蝠体内携带有多种类型的冠状病毒。遗传及系统进化分析结果也显示 MERS-CoV 在亲缘关系上更接近于亚洲、欧洲、南非、加纳等蝙蝠体内的冠状病毒,尤其是和扁颅蝠冠状病毒HKU4和伏翼蝙蝠冠状病毒HKU5为接近[1]。从沙特的一只蝙蝠粪便内检测到病毒 RNA RdRp基因的一段包含190个核苷酸序列和附近患者体内分离到的 MERS-CoV 序列完全相同。但该研究样本数太少,而且蝙蝠与人类的接触十分有限,因此专家推测,在蝙蝠和人之间可能还有另一中间宿主作为连接放大器,能使病毒在其体内大量扩增,使之更易于传播给人。研究人员对中东地区的其他动物也进行了研究。 Reusken[2]等在来自阿曼的全部50头单峰骆驼(100%)和西班牙加那利群岛105头骆驼中的15头(14%)的血清样本中检测到抗MERS-CoV刺突蛋白的特异性抗体,但在骆驼的血液及粪便中并没有检测到病毒的核酸,而在当地养殖的绵羊、山羊、牛及北欧单驼峰的血清样本中未检出抗 MERS-CoV 刺突蛋白的特异性抗体。 Hemida等[3]对沙特阿拉伯两个区的单峰驼及其他家畜的研究也获得相似的结果,大部分单峰驼血清内抗体阳性,绵羊、山羊、牛及鸡的血清内抗体阴性。2014年Hemida等研究了在骆驼体内分离到的MERS-CoV,发现且全基因组序列和人体内分离到的病毒序列具有99.9%的相似性,只在S蛋白基因的受体结合域( RBD)之外发现6个核苷酸突变,但并不影响和细胞表面受体结合。 Hemida等还在骆驼的鼻拭子样品及粪便内检测到病毒,且鼻拭子样品内的病毒检测率更高[4]。初步研究还发现,骆驼体内的MERS-CoV预存抗体并不能有效保护动物免受感染。从沙特全国范围内采集的200多头单峰驼血液样本中,也发现74%的样本显示血清抗体阳性。进一步的病毒核酸检测发现,病毒主要存在于骆驼的呼吸道中,部分粪便样品中也能检测到病毒核酸。对1992~2010年间采集的骆驼血液样本的分析表明,这种病毒在骆驼中存在的历史至少可追溯到1992年,但骆驼没有表现出任何感染症状[5]。
