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SARS冠状病毒S蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化
导致严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的元凶是一种新型的冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV).SARS-CoV感染入侵宿主细胞关键的一环是病毒自身的棘突蛋白(spike protein,S protein)与细胞受体的相互作用,故而S蛋白已成为SARS研究的主要热点.本文通过构建杆状病毒载体,利用昆虫细胞表达体系,在真核细胞中得到了全长S蛋白,并用恢复期SARS患者的血清对其进行了初步鉴定.这为进一步深入研究SARS-CoV S蛋白与宿主细胞的作用机制、研发SARS疫苗等提供了实验材料.
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重组变应原研究开发的新策略
变应性疾病一般指Ⅰ型过敏性疾病,表现为变应性眼鼻炎、变应性哮喘等,影响了世界人口的15%~25%,血清抑制治疗(SIT)是惟一病因治疗.近十几年来,分子生物学技术的发展解决了许多重要变应原DNA的分离、编码、表达和纯化等问题,合成的重组变应原去除了粗制天然变应原提取物中的无关物质,减低了血清抑制治疗的风险,但仍存在免疫效果不理想等问题.近年随着基因工程技术应用于变态反应学,合成高免疫原性而变应原性低的重组低致敏性变应原或衍生物疫苗(hypoallergenic allergy vaccines)成为重组变应原研究开发的新策略[1].本文对近年应用于诊断和治疗的新型重组变应原及衍生物简介如下.
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日本血吸虫29000膜外蛋白的表达和纯化及功能初步鉴定
随着血吸虫病防治工作的不断深入及血防形势的改变,血吸虫病流行的特点对本病的诊断提出了更高的要求.因表膜蛋白更易接触机体的免疫系统,刺激机体产生相对应的抗体,大多研究都支持虫体的表膜蛋白较其他蛋白有较好的诊断价值.本课题组将日本血吸虫(Schistosoma japouicam,Sj)中国大陆株29 000表膜蛋白的膜外区基因体外重组并表达,纯化后初步鉴定其免疫原性和免疫反应性,希望可用于日本血吸虫病的免疫诊断和疗效考核.
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中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1基因的克隆与表达
目的:克隆和表达中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1;ⅡMP-1)基因,获得具有抗原性的人TIMP-1蛋白.方法:用RT-nest-PCR扩增TIMP-1编码区基因片段,用基因重组技术构建含该片段的重组质粒并进行序列分析.在大肠杆菌E.coli中表达融合蛋白MBP-TIMP-1,用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析鉴定,并用亲和层析试剂盒纯化融合蛋白MBP-TIMP-1.结果:经核苷酸序列分析表明,本研究克隆的中国人TIMP-1为624bp,与报道的国外TIMP-1基因序列同源.经SDS-PAGE和Western blot表明,表达的融合蛋白MBP-TIMP-1分子质量为66Ku,具有TIMP-1的抗原性,并可进行亲和层析纯化.结论:克隆了中国人TIMP-1基因,表达和纯化了具有免疫原性的融合蛋白MBP-TIMP-1,他将对肝纤维化的诊断有一定作用.
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SmD1重组蛋白及抗原表位肽段在系统性红斑狼疮中的临床意义
系统性红斑狼疮(SLE)是自身免疫介导的,以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病.抗Sm抗体由于其在SLE诊断中具有高度特异性被认为是疾病的标志性抗体.目前研究认为,SmD1是其中主要的抗原分子.本研究通过构建表达载体进行重组SmD1蛋白的表达和纯化的方法获取纯度较高的抗原,并通过生物学软件设计并化学合成SmD1抗原表位肽段,用ELISA法分别检测其在SLE中的临床意义.
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HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体的构建及其表达和纯化
目的:构建HIV-1ⅢB标准株、中国大陆地区主要流行株CRF-BC和海南省流行株CRF-AE野生型和突变型gp41表达载体,获得gp41重组蛋白.方法:利用基因定点突变的方法,将HIV-1ⅢB、CRF-BC和CRF-AE流行株野生型gp41基因中特定的N611Q糖基化位点天冬酰胺Asn突变为谷氨酰胺Gln,使该位点去糖基化.利用基因工程技术构建野生型pcDNA3.1-gp41和突变型pcDNA3.1-Mgp41表达载体.取测序正确的重组质粒转染293 T细胞,重组蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用免疫杂交方法进行分析.结果:测序结果显示野生型gp41的N611糖基化位点均由天冬酰胺(Asn)的编码基因(AAU)突变为谷氨酰胺(Gln)的编码基因(GAA),成功构建了野生型和突变型gp41表达载体.琼脂糖凝胶电泳分析显示野生型和突变型HIV-1 gp41基因大小约为700 bp,Western blot免疫杂交结果显示在26 kD处出现目的条带,与预期一致.结论:成功构建了HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体,为研究去糖基化修饰gp41蛋白与疾病发生发展的分子机制奠定基础.
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霍乱毒素B亚单位的研究进展
现代生物技术的飞速发展,使传统的疫苗生产方式发生了根本的变化,疫苗研究领域变得异常活跃,人们越来越重视多肽衍生疫苗及疫苗佐剂的发展,融合蛋白作为外源抗原决定簇载体的研究也方兴未艾.将相关抗原融合到合适的载体蛋白上具有毒性小、表达和纯化相对容易的特点,同时可将融合的多肽以确定的构型引入免疫系统之中.霍乱毒素 B 亚单位(CTB)因其独特的生理功能,近年来已成为国内国外研究的热点,将它作为载体蛋白和免疫佐剂产生了很多新的免疫疫苗.
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结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化
构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达质粒,并对其表达产物进行纯化.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pET-23a(+),构建pET-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3);PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白.从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出esat-6基因片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别.利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础.
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SARS冠状病毒S蛋白部分序列1的纯化及免疫活性分析
表达和纯化SARS冠状病毒S蛋白部分序列1(S1),分析其诱导的免疫应答.大量诱导表达SARS冠状病毒S1蛋白,亲和层析予以纯化;用纯化蛋白免疫小鼠,分析S1蛋白诱导的免疫应答.亲和层析纯化获得能被SARS病人混合血清识别的S1蛋白,融合蛋白免疫小鼠三次后诱导产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答.纯化的S1蛋白有良好的免疫学活性.
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SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答
表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答.方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答.N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答.成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性.
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重组弓形虫GRA4的原核表达与纯化
构建能在pET原核系统中高效表达的弓形虫致密颗粒蛋白GRA4基因的重组表达质粒,并对其表达产物进行纯化.采用PCR方法自pMD1 8-GRA4(pGEX)重组子中扩增GRA4基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-23a(+),转化E.coliBL21(DE3),以His·BindTM柱亲和层析纯化表达产物;用此纯化重组蛋白加CFA经皮下注射免疫小鼠三次,间接ELISA法测定其特异性抗体滴度.成功构建了重组表达质粒pET-GRA4,SDS-PAGE显示其表达产物约为40kD,主要以包涵体的形式存在,经亲和纯化后的pET-GRA4重组蛋白产量大、纯度高,能被兔抗弓形虫免疫血清所识别;免疫小鼠后亦可诱导产生出高滴度的特异性IgG抗体.利用pET原核系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础.
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重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答
表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答.从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答.GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性.
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对虾白斑病毒1197基因的表达和产物纯化的研究
1993年以来,我国沿海省份相继发生养殖对虾大批死亡现象,损失严重,引起国内外研究者的重视.经过一段时间的努力研究后,我们报导了引起该病的病原是一种无包含体的杆形病毒[1].此后,该病毒的一些其他特性及引起对虾的病理学及组织学的变化又陆续见诸于报导[2,3].前文中我们报导了该病毒的一个早晚期基因1197的克隆和序列分析,并针对此基因设计了二个核酶,在体外成功地对此基因进行了切割[4].本文报导我们对该基因进行了原核表达,并对表达产物进行了纯化的研究,以期为阐明该基因表达产物的功能打下进一步研究的基础.
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FimH重组蛋白的原核表达及纯化
目的:在大肠杆菌中构建并表达3种FimH重组蛋白,并对FimH重组蛋白的培养条件进行优化,制备高纯度FimH重组蛋白.方法:采用原核表达载体pET28a构建出能表达FimH的重组质粒,并分别对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等条件进行优化,以提高重组蛋白的产量和增大其可溶性,后以亲和层析分离纯化3种FimH重组蛋白.结果:成功构建出表达大肠杆菌(K12,BL21)和沙门氏菌(S.T.)FimH的原核表达载体pET28a-K12/BL21/S.T.,经酶切、测序和Western Blot鉴定,目的蛋白表达正确.在适当浓度的IPTG诱导,15℃震荡培养20 h,可使FimH的表达量达到大,分离纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为一条带.结论:本研究构建以3种FimH为表面呈现系统的表达载体,3种FimH基因和预测蛋白结构略有差异.本研究为后续研究3种蛋白 生物活性差异及其靶向M细胞的免疫佐剂活性提供物质基础.
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泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化方法的优化
目的:筛选和优化泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中表达和纯化的方法,为进一步筛选Em18抗原表位奠定基础.方法:原核表达pET41a-Em18重组质粒,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导、表达,获得rEm18-GST蛋白,采用不同的超声程序破碎大肠杆菌细胞,分别采用GST柱、His柱及两者结合方法,改变不同的平衡、洗涤和洗脱缓冲液浓度,纯化rEm18-GST蛋白.结果:(1) rEm18-GST蛋白在相对分子质量为50 kDa处有表达条带,蛋白表达量随诱导时间的延长而增加;(2)超声程序为工作1 s,间歇3 s,每个循环时程10 min,加入蛋白酶抑制剂,可降低目的蛋白的降解;(3)采用单纯His柱可获得回收量高、纯度高的rEm18-GST蛋白.结论:(1)对含有GST-tag和His-tag双重标签重组蛋白的纯化,应用His柱更有效,更经济;(2)建立和优化一套从大肠杆菌细胞中分离纯化重组Em18蛋白的有效方法.