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SDS 和2-ME在HCV重组抗原包被工艺中的应用
为提高间接ELISA法检测抗-HCV诊断试剂盒的灵敏度,将含有十二烷基硫酸钠(SDS)与巯基乙醇(2-ME)的包被液对HCV重组抗原的固相化,与不加入上述上述两种化学物质的包被液进行对比.结果发现,在包被液中加入适宜浓度的SDS和2-ME,有效的提高了间接ELISA检测抗-HCV试剂的灵敏度,而试剂的特异性则保持不变,优化了临床标本的反应模式.在包被液中同时加入SDS和2-ME,有效的改变了HCV重组抗原的包被效果,优化了抗-HCV诊断试剂盒的生产工艺.
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大鼠骨髓基质干细胞分化为胰岛样细胞
目的:探讨体外自体骨髓基质干细胞(MSC)定向诱导分化为胰岛样细胞的可能性,为进一步诱导分化胰岛细胞治疗糖尿病奠定实验和理论基础.方法:对Wistar大鼠骨髓基质干细胞(MSC)进行体外培养,通过不同的条件诱导MSC向胰岛样细胞分化:LN组,10 mmoL/L尼克酰胺+1 mmoL/L β-巯基乙醇的L-DMEM(含20 mL/L FBS)预先诱导24 h,10 mmoL/L尼克酰胺+1mmol/L β-巯基乙醇的无血清H-DMEM诱导10 h.HN组,含20 mmoL/L尼克酰胺的L-DMEM(20 mL/L FBS)预先诱导24 h,20 mmoL/L尼克酰胺的无血清H-DMEM诱导10 h.诱导细胞形态通过倒置显微镜观察,并通过免疫细胞化学检测分化细胞表达Insulin和Nestin.向3只Streptozotocin(STZ)诱导糖尿病大鼠皮下种植MSC分化胰岛细胞1×107,1 wk后观察大鼠血糖水平变化.结果:LN、HN组细胞均可见部分骨髓基质干细胞分化、增生,形成胰岛样细胞团,部分细胞向神经元样细胞分化,对照组细胞未见明显分化.免疫细胞化学显示Insulin在诱导细胞呈显著表达,Nestin在分化前细胞显著表达.皮下种植MSC分化胰岛细胞可有效降低STZ糖尿病大鼠的血糖水平.结论:体外诱导骨髓基质干细胞定向分化为胰岛样细胞存在可行性,本实验将可能为临床糖尿病干细胞治疗提供新的途径.
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病原菌金属β-内酰胺酶筛查方法的比较
目的 比较5种不同化合物对病原菌金属;内酰胺酶(MBL)的抑制作用,建立一种检测MBL的简便方法.方法 在亚胺培南(IMP)纸片上滴加不同浓度的抑制剂,观察各自的抑菌环大小和清晰程度(Hodge试验);以IMP作为指示药物,在相邻的纸片上加抑制剂,即双纸片协同试验(DDSTs),再对抑制剂浓度和两者间的距离进行条件优化,选择出检测MBL的佳方法.结果 Hodge试验和DDSTs中均以巯基乙醇对MBL的抑制作用强,将其作1:15稀释后,巯基乙醇自身的抑菌环消失,与IMP纸片相距3 mm时,可清晰而准确地检测出MBL.结论 巯基乙醇和IMP双纸片协同试验可优化MBL的检测.
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人骨髓基质细胞向神经元分化的两种体外诱导方法比较
目的通过体外定向诱导人骨髓基质细胞(hBMSCs)使其分化为神经元,比较两种诱导方法.方法采用Percoll-Paque液(1.073g/m1)分离hBMSCs,体外扩增培养后,分别加入丁羟茴醚(BHA)+二甲基亚砜(DMSO)和β-巯基乙醇(BME)诱导hBMSCs分化为神经元,光镜下形态学观察,及免疫组化检测特异性神经元烯醇化酶(NSE),神经丝蛋白(NF),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数.结果 hBMSCs在加入两种诱导剂后均有胞体收缩,突起伸出,NSE,NF,GFAP均有不同程度阳性率,但丁羟回醚+二甲基亚酚组的细胞存活率高,神经元阳性率(诱导成功率)高.结论丁羟茴醚+二甲基亚酚是一种较好的体外诱导hBMSCs分化为神经元的诱导剂.
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不同处理条件对孕妇IgG抗A(B)抗体测定的影响
新生儿溶血病(HDN)包括ABO溶血和Rh溶血,前者在我国较为常见,准确测定孕妇血清中IgG抗A(B)的效价是预测和判断新生儿溶血病发生的重要依据,目前检测IgG抗A(B)2-巯基乙醇(2-Me)处理时间有的实验室用30min,有的用2h、有的用2.5h.为了了解2-Me的处理时间对测定的结果的影响,本文对36例孕妇的标本进行了不同时间的处理,现将结果报告如下.
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巯基乙醇和维生素C对镉孵育红细胞GSH-Px活性的影响
目的探讨巯基乙醇和维生素C对镉孵育红细胞GSH-Px活性的影响.方法用酶联法分别测定对照组RBC、Cd孵育RBC、巯基乙醇+Cd孵育RBC、VitC+Cd孵育RBC的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性.结果①Cd孵育RBC 的GSH-Px活性显著低于对照组(P<0.01);②巯基乙醇+Cd孵育RBC的GSH-Px活性与Cd孵育RBC的GSH-Px活性无显著性差异;③VitC+Cd孵育RBC的GSH-Px活性显著高于Cd孵育组(P<0.01).结论①加入到抗凝血中的Cd易进入RBC中,并抑制RBC的GSH-Px活性,且随进入到RBC中的Cd浓度的增加而增加;②巯基乙醇(2μl/ml血)不能有效地阻断Cd对RBC的GSH-Px活性的抑制;③VitC可显著改善Cd对RBC的GSH-Px活性的抑制作用.
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骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的研究进展
骨髓基质细胞(BMSCs)在诱导剂的作用下在体外可以定向分化为神经元样细胞,但尚未在临床上广泛使用,主要的原因是神经元样细胞的数量和纯度不够.在骨髓基质细胞诱导分化为神经元样细胞的研究中,诱导剂的选择是关键,目前常见的诱导剂有β-巯基乙醇、细胞因子等.近年来发现利用中药也可以进行诱导分化.
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β-巯基乙醇和神经生长因子定向诱导鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞的验证
目的:验证β-巯基乙醇、神经生长因子对大鼠骨髓基质细胞体外定向诱导分化为神经细胞的可行性.方法:实验于2005-05/2006-02在锦州医学院外科实验室完成.①选取清洁级1月龄SD大鼠30只,全骨髓培养法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞.②取第3代骨髓基质细胞,以含胎牛血清的DMEM培养液培养消化后,计数细胞量,描绘细胞增殖曲线.③取第3～5代骨髓基质细胞,接近70%～80%融合后,分为3组:β-巯基乙醇诱导组:加入含1 mmol/L β-巯基乙醇的无血清培养基预诱导24 h后,去除预诱导液,再加入含5 mmol/L β-巯基乙醇的无血清培养基诱导5 h;神经生长因子诱导组:加入碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L进行预诱导24 h后,去除预诱导剂,磷酸盐缓冲液洗涤3次,再加入含神经生长因子50 μg/L无血清培养基诱导24 h;阴性对照组:仅加等量无血清培养基.观察各组诱导后细胞的形态学改变.④免疫组化法检测诱导后各组细胞的神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白和胶质纤维酸性蛋白的表达和分化率.结果:①骨髓基质细胞的生长曲线:培养第1～4天为潜伏期,此后细胞增殖加速并进入对数生长期,第9天达到高峰,以后细胞增值速度减慢,进人平台期.骨髓基质细胞倍增时间约为32 h.②骨髓基质细胞诱导分化后的形态学观察结果:β-巯基乙醇诱导组经β-巯基乙醇诱导1 h,细胞形态即发生改变,胞体收缩成球形或锥形,折光性增强,部分细胞周围有光晕,有较多长突起.5 h后,神经元样细胞明显增多,可形成神经网络状结构,但是死亡细胞逐渐增多;神经生长因子诱导组形态学变化出现较迟,在12 h才有明显的形态学改变,表现为胞体变大,有类似轴突和树突的细长突起.24 h表现更为明显,部分细胞间也可见网络状排列,细胞死亡现象不明显;阴性对照组无明显的形态学改变,仍为长梭形细胞.③神经元样细胞免疫组化测定结果:β-巯基乙醇诱导组、神经生长因子诱导组神经细胞特异性烯醇化酶、微管相关蛋白表达均为阳性,表现为胞体和突起被染成棕黄色,而胶质纤维酸性蛋白呈阴性;阴性对照组无阳性结果出现.β-巯基乙醇诱导组神经细胞特异性烯醇化酶、微管相关蛋白分化率分别为(71.2±3.8)%和(64.1±2.7)%,神经生长因子诱导组分别为(46.2±2.5)%和(42.9±1.9)%,两组间差异有显著性意义(P＜0.05,t=-5.205).结论:β-巯基乙醇、神经生长因子均可成功诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞.
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不同代数成人骨髓间充质干细胞体外转化为神经细胞的实验
背景:骨髓间充质干细胞是一种具有自我复制及多向分化潜能的干细胞,在体外可以向神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞分化.目的:观察不同代数的成人骨髓间充质干细胞体外向神经元细胞转化的效率,为骨髓间充质干细胞应用于临床提供可靠的实验数据.设计:单一样本实验.单位:吉林大学中日联谊医院神经内科.对象:骨髓组织取自吉林大学第一医院骨科行脊柱融合术患者9例,男6例,女3例;患者均知情同意.方法:实验于2002-09/2003-02在吉林大学中日联谊医院中心实验室完成.对成人骨髓间充质干细胞的原代和传代培养.分为实验组和对照组,实验组又分:神经元烯醇化酶组,神经丝蛋白-M组,胶质纤维酸性蛋白组和尼氏染色组.采用β-巯基乙醇做为诱导剂,选用第2,4,6,8代成人骨髓间充质干细胞在体外诱导6 h后,用细胞化学及免疫组织化学检测神经元细胞、星形胶质细胞标记蛋白的表达.主要观察指标:①成人骨髓间充质干细胞传代培养的生长曲线分析.②尼氏染色结果.③免疫组织化学染色结果.结果:①传代培养具有以下共性特征:传代培养潜伏期12～24 h;传代培养对数增殖期约为7～10 d,11～13 d进入细胞生长平台期.②第2,4,6代成人骨髓间充质干细胞诱导后胞浆中均可见深蓝色的颗粒状尼氏体,第8代诱导6 h后胞浆中未见明显的深蓝色尼氏体结构.③不同代数的成人骨髓间充质干细胞经诱导6 h后均表达神经元烯醇化酶、神经丝蛋白-M,不表达胶质纤维酸性蛋白;第2,4,6代的阳性率无显著性差异(P＞0.05),第8代与第2,4,6代的阳性率有显著性差异(P＜0.05).结论:β-巯基乙醇在体外可定向诱导成人骨髓间充质干细胞转化为神经元细胞,第2,4,6代的阳性率明显高于第8代.
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正常和去卵巢大鼠骨组织白细胞介素6 mRNA表达水平的研究
绝经后妇女由于卵巢功能低下,雌激素明显减少,导致骨重建偶联过程失衡,骨吸收超过骨形成,终致骨量减少,骨强度降低,出现骨质疏松.近年来,雌激素对细胞因子的调节在绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis,PMO)发病中的作用受到重视.本实验旨在探讨雌激素对白细胞介素(IL-6)基因表达的调节及其与骨密度之间的关系.一、材料和方法1.主要试剂及仪器:RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Taq酶、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇及DEPC均为Promega产品.DNA markers(SABC)购自华美公司,引物由上海生物工程公司合成.雌激素试剂盒为天津德普生物公司产品,尼尔雌醇为北京四环二厂产品.十二烷基肌氨酸钠、琼脂糖均为本室进口试剂.其他试剂均为国产分析纯.
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人骨髓间充质干细胞的分离培养和向神经细胞分化的研究
目的分离骨髓后培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),进行体外传代扩增,并探索体外诱导分化为神经元样细胞的方法.方法抽取人骨髓血,percoll-paque液(1.073 g/m1)分离,DMEM/20%FCS培养传代,至第3～5代时加入巯基乙醇(BME),观察hMSCs分化为神经元样细胞的形态学变化.结果hMSCs在体外可以实现数目扩增,在特定诱导剂的作用下向神经元样细胞分化.结论采用少量骨髓样本,经培养获得充足的细胞量,满足定向诱导和细胞移植的需要.
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人骨髓基质细胞向神经细胞分化的方法学研究
目的改进采用人骨髓体外培养人骨髓基质细胞(hBMSCs),进行体外传代扩增,并探索体外诱导分化为神经元样细胞的方法.方法抽取人骨髓血,淋巴细胞分离液分离,DMEM/15%人血清培养传代,至第3～5代时加入巯基乙醇(BME),观察hBMSCs分化为神经元样细胞的形态学变化.结果该方法hBMSCs在体外可以实现数目扩增,在特定诱导剂的作用下向神经元样细胞分化.结论采用少量骨髓样本,既可培养获得充足的细胞量,可以满足定向诱导和细胞移植的需要.
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β-巯基乙醇和脑匀浆上清对骨髓间充质干细胞的神经诱导作用
目的 探讨β-巯基乙醇(BME)和大鼠脑匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为类神经元样细胞的作用.方法 采用全骨髓培养法从SD大鼠骨髓中分离培养MSCs,经贴壁法体外扩增、传代和流式细胞仪鉴定.①以1mmol/L浓度BME的含血清:DMEM培养基预诱导24h,再以含5mmol/LBME的无血清DMEM培养基诱导5h至MSCs神经分化.②使用大鼠脑匀浆上清诱导MSCs,48h至神经分化.免疫细胞化学染色分别检测两种诱导方法MSCs培养物神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 第5代MSCs有97.5%表达CD90抗原,1.72%表达CD45抗原.两种方法诱导后的细胞均具有神经细胞的形态特征;相比脑匀浆上清BME诱导组细胞形态变化更快.两种方法都可诱导MSCs表达NSE;鼠脑匀浆上清可诱导MSCs表达GFAP.结论 MSCs具有向神经细胞分化的可塑性,相比BME,鼠脑匀浆上清具有诱导MSCs向胶质细胞分化的倾向.
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恙虫病立克次体蛋白抗原及其编码基因研究进展
恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi)是恙虫病(Scrub typhus)的病原体，专性活细胞内寄生，革兰氏阴性，恙螨是其传播媒介。在分类地位上，恙虫病立克次体原属于立克次体科立克次体属，但由于其在许多生物学和遗传特性方面不同与其他立克次体，1995年将其另立一属一东方体属(Orientia)，称为恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)[1]。近十多年来，新的技术方法尤其分子生物学方法不断引入恙虫病立克次体的研究，使病原学研究更加系统深入广泛。现对其蛋白抗原与其编码基因的研究综述如下。1 恙虫病立克次体的多肽组成 纯化的恙虫病立克次体裂解物或蛋白抗原或多肽经SDS－PAGE电泳，发现有30多条带[2]。其中主要的多肽为56kD，58kD，47kD，70kD。由于各实验室实验条件的不一致，使得恙虫病立克次体多肽的命名也较为混乱，同一多肽有不同的名称。例如58kD(Hanson称为63kD，Tamura称其为60kD)，56kD(Hanson称为60kD)，47kD(Hanson称为50kD)。恙虫病立克次体各株SDS－PAGE电泳图谱是相似的，但某些多肽的分子量有细微的差别。如Kato株56kD多肽比其他株47kD(Gilliam，Karp，Shimokoshi)的分子量大。这与Melinda F.Moree等的发现是一致的[3](见表1)。菌体蛋白的迁移还受温度，2－巯基乙醇等样品制备条件的影响[4,3]。同一多肽分子，不同制备条件下会以不同的状态存在(见表2)。由表2可见，56kD蛋白是一个热修饰蛋白，其存在状态依温度不同而异。
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人胎盘碱性磷酸酶复性效率的影响因素探讨
目的:研究人胎盘碱性磷酸酶(HPAP)在盐酸胍变性态酶复性过程中加入巯基乙醇对其复性的影响,旨在探讨变性态酶的适复性条件.方法:应用分光光度法和荧光法进行HPAP的盐酸胍变性及其加入巯基乙醇后变性态酶的复性.结果:在HPAP变性态酶复性过程中加入巯基乙醇,变性中间态酶仍可完全复性:变性态酶的复性率有明显的提高.复性率由27%增加到了68.5%,荧光发射波长由358 nm进而蓝移到347.5nm.结论:巯基乙醇可以提高HPAP胍变性酶的复性效率,从而更深入地阐明了HPAP结构与功能的关系.
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2-巯基乙醇裂解IgM抗体实验条件的改良
新生儿溶血(HDN)是由母婴血型不相合时,胎儿红细胞进入母体血循环,母体产生了相应的IgG类抗体,此类抗体通过胎盘,作用于胎儿红细胞,使之产生不同程度的溶血[1].产前检查IgG抗体的效价,能够对HDN的发生、发展提供早期辅助诊断依据而具有重要的临床意义.本文分别用2-巯基乙醇通过2种方法3种不同的水浴时间处理IgM,比较其对IgM的破坏率,旨在发现更简便、准确的实验方法,现报道如下.
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血型物质和巯基乙醇中和完全抗体后IgG抗体效价比较
目的 探讨两种方法中和孕妇血液中血型完全抗体后,免疫性抗-A(IgG)抗体效价临界值.方法 选择丈夫为A型、孕妇为O型的抗-A(IgG)抗体效价为1∶(4～1 024)血液标本50份,经血型物质和巯基乙醇(2-Me)中和完全抗体后采用抗人球蛋白法检测抗-A(IgG)抗体效价.结果 血型物质和2-Me两种方法中和完全抗体后测得抗-A(IgG)抗体效价均数分别为22.01和36.25,差异有统计学意义(P<0.001).孕妇血液经血型物质和2-Me两种方法中和完全抗体后IgG抗体效价临界值应分别设定为1∶16和1∶64.结论 血型物质和2-Me中和完全抗体的能力有差异,因此进行新生儿溶血病检查时应注意采用不同临界值.
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某巯基乙醇生产企业职业病危害识别及关键控制点
目的 识别巯基乙醇生产过程中产生的职业病危害因素,确定主要职业病危害因素及关键控制点,并提出有针对性的防治对策.方法 通过职业卫生现场调查和检测,采用检查表法及定量分级法进行分析与评价.结果 巯基乙醇生产项目存在的职业病危害因素是硫化氢、二氧化硫、噪声等.结论 巯基乙醇生产过程中职业病危害因素较多,存在多种高毒物质,潜在急性中毒风险,应加强关键环节的职业病危害防治和应急救援.
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人胸腺细胞与小鼠脾细胞体外共同孵育的MTT比色法测定
为了观察人胸腺细胞与小鼠脾细胞的关系,我们运用了M TT比色法进行体外测定.人胸腺取材于胸外科手术及妇产科手术,年龄在5月-6岁范围内.将胸腺块消毒、剪碎并研磨,尼龙网过滤后进行体外原代细胞培养,T细胞密度与小鼠脾细胞密度均为1x106/ml,培养基为DMEM,添加15%小牛血清、25mM hepes、4mM谷氨酰胺、10μM 2-巯基乙醇、2mM丙酮酸钠、100U/ ml青霉素及100μg/ml链霉素,37℃、5% CO2孵箱孵育1月.60μl 人卵巢癌细胞与60μl人胸腺细胞体外共同孵育作为实验组,60μl DMEM与60 μl人胸腺细胞孵育作为阴性对照.2天后,进行96孔板MTT比色法体外测定T细胞活率 .10μlMTT溶液加入每孔中,将96孔板置于孵箱中,4小时后,100μl 20% SDS加入每孔中,过夜后检测OD值.实验组的OD值(OD＝0.0462,平均1 .3287±0.3538)高于阴性对照组(OD＝0.045,平均0.5270±0 .0582),P＜0.01,说明小鼠脾细胞能促使人T细胞增殖.
