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灌注式生物反应器中流体剪切力对大段组织工程化骨构建的作用
目的 结合流体力学模型研究灌注式生物反应器中大段组织工程化骨的构建与多孔支架内流体剪切力的关系.方法 利用灌注式生物反应器对复合骨髓基质干细胞的多孔磷酸三钙支架进行灌注培养.培养基的黏度分别为1.12 mPa·s,2.23 mPa·s及3.35 mPa·s.通过细胞增殖、成骨分化及组织形态学评价组织T程化骨的构建,建立流体力学模型,求解支架内的流体剪切力.结果 培养基黏度2.23 mPa·S组,细胞增殖高于其他组.培养基黏度2.23 mPa·s及3.35 mPa·s组第28 d的碱性磷酸酶活性及第7 d后的骨钙素分泌高于1.12 mPa·s组.培养基黏度越高,骨桥蛋白的分泌高峰出现越早.28 d后,黏度3.35 mPa·s组的钙化基质多.流体力学模型分析,培养基黏度1.12 mPa·s,2.23 mPa·s及3.35 mPa·s组中,支架内的平均流体剪切力分别为5 mPa,11 mPa和15 mPa.结论 在利用复合人骨髓基质干细胞的多孔磷酸三钙构建大段组织工程化骨的过程中,15 mPa的流体剪切力有利于组织工程化骨的构建.
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流体剪切力诱导喉鳞癌Hep2细胞上皮-间充质转化
目的 探究流体剪切力(fluid shear stress,FSS)对喉鳞癌Hep2细胞发生上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的影响.方法 对Hep2细胞加载140 mPa的FSS,观察不同时间点细胞的形态学变化;划痕实验检测力学加载后Hep2细胞迁移能力的变化;共聚焦显微镜下观察细胞骨架蛋白F-actin的分布;Western blotting检测EMT相关蛋白的表达.结果 FSS力学加载后,Hep2细胞形态由多边形向梭形转变,撤销FSS后,细胞恢复初始的多边形;Hep2细胞迁移能力的增加依赖于FSS加载时间.FSS促使细胞骨架蛋白F-actin重排,从而增强Hep2细胞的迁移行为.FSS使Hep2细胞EMT标志蛋白发生了时序性变化.结论 FSS是诱导Hep2细胞发生EMT的一个重要物理因素.
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流体剪切力对成骨细胞凋亡及bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响
目的:探讨流体剪切力对成骨细胞凋亡及相关蛋白bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响.方法:对培养的第3代新生大鼠成骨细胞分别加载0(对照组)、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 Pa流体剪切力1h后,静止培养24h.应用TUNEL法检测凋亡.采用免疫组化法检测bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白.采用SPSS11.5软件包对数据进行单因素方差分析.结果:在0、0.6、1.0、2.0 Pa组,细胞凋亡及bcl-2、Caspase-3表达量无显著差异,P＞0.05.3.0、4.0、5.0 Pa组间,随剪切力增大,细胞凋亡增加,Bcl-2表达量减少,Caspase-3增加,P＜0.05.所有实验组间Bax无显著差异,P＞0.05.结论:生理范围的流体剪切力对成骨细胞凋亡无影响,而过大力值导致bcl-2表达减少,进而活化caspase-3,成骨细胞凋亡增加.
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纤维粘连蛋白与流体剪切力对体外培养的牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响
目的:在体外利用流体剪切力模拟咬合创伤,对牙周膜成纤维细胞(HPDLF)给予不同浓度的纤维粘连蛋白(FN)处理,在不同时段测量HPDLF的COX-2mRNA的表达量,以期模拟HPDLF在口腔存在咬合创伤的情况下FN对其生物学行为的影响.方法:收集因正畸矫治需要拔除的健康年轻恒牙,以第3代细胞作为研究对象.样本分为A、B 2组,A组为利用水平摇床施加剪切力培养,转速为35r/min;B组为静态培养.A、B 2组中分别分为加入FN0μg/ml(对照)、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml等4组,每组4孔.无血清培养6h、12h.采用SPSS13.0软件包对结果进行配对t检验.结果:HPDLF原代培养,24h后80%组织块贴壁.7~10d有细胞从组织块周围游出.14d左右长满培养瓶.免疫组化染色显示抗波丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性.RT-PCR结果显示,A组6h后COX-2表达即有体现;12h后,相同FN用量的样本的COX-2表达量较加力6h时高,且表达量随着FN用量的增加而减少.B组中,各样本电泳结果为阴性.光密度扫描分析,配对t检验结果t=13.45,P＜0.01.结论:流体剪切力可以引起HPDLF的炎性反应.人血浆FN可以减少HPDLF的COX-2mRNA表达,呈时间、剂量依赖性.
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体外流体剪切力作用下的骨髓间充质干细胞与树突状细胞的相互粘附作用观察
目的：建立一种新方法来观察细胞之间的相互粘附作用。方法利用BioFlux数控剪切流条件下活细胞功能分析自动化系统，首先将C57骨髓间充质干细胞（C57-BMSC）、CD45+CD31+BMSC和CD45-CD31-BMSC三种细胞在微流体通道上包被，用Calcein-AM对DC细胞进行染色，将染色的细胞在特定剪切力下（0.5dynes/cm2）引入小室内，通过荧光倒置显微镜和BioFlux软件系统进行图像捕捉和数据分析。结果在荧光倒置显微镜下观察和BioFlux软件统计分析，结果显示CD45+CD31+BMSC与未分选的C57-BMSC粘附的DC数量上无差异，CD45-CD31-BMSC粘附的DC细胞明显减少。结论利用BioFlux数控剪切流条件下活细胞功能分析自动化系统可以直观观察细胞之间的粘附作用。
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平行平板流动腔的研究进展
流体剪切力对细胞的影响是口前细胞生物学和细胞力学研究的一个重要课题,平行平板流动腔是目前研究细胞在切应力作用下变化规律的主要装置之一,本文就平行平板流动腔的基本结构、优化设计、应用等做一综述.
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流体剪切力对成骨细胞影响的研究进展
骨是一个富含多孔的组织,被组织间液持续灌流,由于受血压和活体外机械装载的驱使,组织间液经过骨组织中的腔隙、小管网和骨内膜表面的骨内层产生明显的流体剪切力(fluid shear stress,FSS).大量研究表明,成骨细胞是其中重要的感受与效应细胞, 可通过力敏感离子通道、G蛋白与酪氨酸激酶、整合素受体与细胞骨架等多种途径感受体内外力学刺激, 并将力学刺激信号转化为细胞生物化学信号,介导力相关敏感基因表达, 合成各种酶类等活性物质, 激活信号网络级联反应, 参与一系
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破骨细胞在剪切应力下形态改变及降钙素受体mRNA表达差异的研究
目的 对流体剪切力作用下破骨细胞降钙素受体Mrna的表达水平进行研究.方法 采用1α,25-(OH)2D3诱导5周龄SD大鼠骨髓细胞体外培养破骨细胞,观察不同流体剪切力对其形态的影响,运用荧光定量RT-PCR方法检测破骨细胞降钙素受体Mrna在不同力值下表达的差异.结果 研究发现,破骨细胞在流体剪切力的作用下形态有较大改变,主要在细胞膜部位,可能与破骨细胞细胞骨架的适应性改变相关;流体剪切力对CTR Mrna的表达为上升调节(15 mins组除外).
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流体剪切力调节血管内皮细胞自噬的研究进展
细胞自噬作为细胞的一种防御和应激调控机制,参与维持细胞的代谢平衡.在血管内皮细胞中,自噬是影响内皮细胞功能的一个重要因素.流体剪切力也是影响血管内皮细胞形态和功能的重要因素之一.而血管内皮细胞生理功能的维持在整个心血管系统的正常运转中起着重要的作用.我们主要对血管内皮细胞的功能,细胞自噬和流体剪切力对血管内皮细胞功能的调节作用,以及流体剪切力对血管内皮细胞自噬的调节作用等方面进行综述.
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转染 ClC-3 siRNA 的大鼠成骨细胞增殖、分化观察
目的：观察转染ClC-3 siRNA的大鼠成骨细胞增殖、分化情况。方法原代提取成骨细胞，将细胞分为四组，Control组细胞不做任何处理，NC组细胞转染无序siRNA，Lipo组细胞转染LipofectamineTM 2000转染试剂， ClC-3 siRNA组细胞转染ClC-3 siRNA，各组细胞加载流体剪切力行力学刺激。采用MMT法检测各组细胞培养24、48、72 h时的光密度值；同时检测各组细胞碱性磷酸酶水平及成骨细胞钙化结节形成能力。结果与Control组相比，ClC-3 siRNA组细胞各时点光密度值降低（P均＜0．01）。 ClC-3 siRNA组、Lipo组、NC组、Control组成骨细胞碱性磷酸酶水平分别为（32．434±2．130）、（46．199±1．900）、（47．347±2．500）、（49．540±1．550） U／mL，钙化结节形成能力分别为25．02％±3．46％、36．83％±4．54％、38．45％±4．84％、40．57％±2．22％，ClC-3 siRNA组与Control组相比，P均＜0．01。结论转染ClC-3 siRNA可抑制大鼠成骨细胞的增殖、分化。
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大鼠肾缺血再灌注过程中流体剪切力的缺失降低腺苷酸活化蛋白激酶的活性
目的 探讨大鼠肾缺血再灌注(IR)过程中流体剪切力(FSS)改变引起肾损伤的机制.方法 1.细胞实验:将人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)分为4组,(1)应用平板流体小室系统对HU-VEC加载12 dyn/cm2的FSS 30、45、90 min;(2)将HUVEC加载FSS2 h后停止加力,并分别培养1、3、8、12 h;(3)将0、1、2、4、8 mmol二甲双胍分别对HUVEC预处理培养24 h;(4)对照组为正常培养HUVEC.采用蛋白质印迹法检测各组细胞内p-AMPK/AMPK蛋白表达水平.2.体内实验:取成功建立IR模型的SD大鼠16只,采用随机数字表法分4组,每组4只:(1)低温静态保存(CS)组:将离体大鼠双肾冷保存4h;(2)低温机械灌注保存(HMP)组:将离体大鼠双肾持续灌注0℃乳酸林格液4h.(3)二甲双胍处理组(Met-CS组):术前连续3d腹腔注射二甲双胍,获取离体大鼠双肾后冷保存4h;(4)对照组离体大鼠双肾热缺血30min后不做任何处理.采用原位末端标记法、HE染色等观察各组大鼠肾组织损伤情况,采用免疫组织化学法检测肾组织内p-AMPK蛋白表达和分布规律.分析FSS缺失与肾组织AMPK表达间的相关性.结果 FSS可上调HUVEC内p-AMPK表达水平,并随作用时间延长表达升高;停力后,HUVEC内p-AMPK蛋白表达随时间延长逐渐降低(P＜0.05);二甲双胍可激活AMPK活性,并随浓度增加而升高(P＜0.05).HMP组肾组织内p-AMPK含量明显高于CS组(P＜0.05),HMP组肾组织内p-AMPK表达主要分布于肾小管处,少数于肾小球内皮细胞和血管处.HMP组肾组织细胞凋亡率明显低于CS组(P＜0.05).HMP组大鼠肾组织损伤轻,无水肿,肾小管轻度扩张;而CS组肾组织损伤严重,肾小管明显水肿.结论 大鼠肾IR过程中,FSS改变可能通过AMPK途径影响肾组织损伤.
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流体剪切力下微小RNA-222调节人髓核细胞c-fos蛋白的表达
目的 探讨流体剪切力作用下微小RNA(microRNA)-222调节人原代髓核细胞c-fos水平.方法 分组:原代人髓核细胞(NPC,n=24)随机平均分为4组:空白对照组(未经任何处理的NPC),在12 dyn/cm2×45 min流体剪切力加载条件下microRNA-222未干扰组(Control组)、microRNA-222过表达组(minic 222组)和microRNA-222沉默组(inhibitor 222组).Western blot检测各组黏着斑激酶(FAK)-细胞外信号调节激酶5(ERK5)信号通路中磷酸化ERK5(p-ERK5)、磷酸化丝裂原细胞外激酶5(p-MEK5)、丝裂原细胞外激酶5(MEK5)及其信号通路下游c-fos的蛋白表达.通过mimic RNA-222及inhibitor RNA-222对microRNA-222进行过表达或沉默,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证过表达或沉默效率,并检测各组c-fos的mRNA水平.结果 流体剪切力加载后,与流体剪切力加载前比较,髓核细胞MEK5蛋白表达降低(空白对照组477.00±25.28,对照组268.83 ±31.78),p-MEK5(空白对照组226.50±25.55,对照组369.00±22.15)、p-ERK5(空白对照组48.17±5.53,对照组85.67±13.32)、c-fos蛋白表达升高(空白对照组646.67±32.59,对照组754.67±37.44).过表达microRNA-222,流体剪切力加载后,与流体剪切力加载前比较,髓核细胞MEK5蛋白表达升高(对照组268.83±31.78,minic 222组374.50±17.21),p-MEK5(对照组369.00±22.15,minic 222组317.50±32.67)、p-ERK5(对照组85.67±13.32,minic 222组65.67±9.94)、c-fos蛋白表达降低(对照组754.67±37.44,minic 222组730.17±21.75).抑制microRNA-222,流体剪切力加载后,与流体剪切力加载前比较,髓核细胞MEK5蛋白表达降低(对照组268.83±31.78,inhibitor 222组176.83±20.88),p-MEK5(对照组369.00±22.15,inhibitor 222组453.00±30.86)、p-ERK5(对照组85.67±13.32,inhibitor 222组109.17±10.30)、c-fos蛋白表达升高(对照组754.67±37.44,inhibitor 222组850.33±33.49),c-fos mRNA表达量(空白对照组545.00±11.75,对照组562.17±28.90,minic 222组548.17±5.53,inhibitor 222组545.33±35.64)、ERK5蛋白表达量(空白对照组328.33±25.87,实验对照组309.83±25.31,minic 222组314.17±24.00,inhibitor 222组309.33±29.66)在各组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 流体剪切力通过抑制microRNA-222促进c-fos蛋白表达并上调髓核细胞骨架关键通路FAK-ERK5活性,加速髓核细胞退变.
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流体剪切力作用下人脂肪基质细胞体外成骨分化的实验研究
目的:分离人体脂肪基质细胞(hADSCs)并研究流体剪切应力对其成骨分化的影响.方法:将脂肪抽吸术获取的人体脂肪进行分离,应用强度为3 dyne/cm2的流体剪切力刺激30 min后观察细胞形态;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖能力,绘制细胞生长曲线;碱性磷酸酶(ALP)及茜素红染色对其成骨分化进行鉴定.结果:胶原酶消化后的脂肪基质细胞呈梭形,经流体剪切力作用培养后,细胞体积明显增大,胞浆丰富并含有较多的细胞器,细胞排列方向与加力方向一致,呈漩涡状生长,生长速度加快.此外,流体剪切力加载后脂肪基质细胞内碱性磷酸酶活性增高,茜素红染色表明聚集的细胞团中心能形成矿化结节.结论:脂肪基质细胞中的成体干细胞经过流体剪切力作用后可向成骨细胞分化并具有明显的成骨表型,可作为骨组织工程的种子细胞.
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流体剪切力对大鼠成骨细胞增殖及细胞周期的影响
目的:观察流体剪切力对大鼠成骨细胞增殖及细胞周期的影响.方法:大鼠成骨细胞受强度为13 dyne/cm2的流体剪切力刺激60 min,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞仪检测细胞的增殖能力和细胞周期.结果:流体剪切力作用后,大鼠成骨细胞增殖能力提高,细胞活性增强.加力组S期细胞百分比(14.67±1.18)%,较对照组S期细胞百分比(8.05±1.08)%约增高82.2%(p＜0.01).结论:流体剪切力具有提高大鼠成骨细胞增殖能力以及增强其细胞活性的作用.
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流体剪切力对5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响
目的 观察5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,并探讨流体剪切力对诱导过程的影响.方法 贴壁法从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行纯化传代培养,取第4代骨髓间充质干细胞以3、5、10、15及20 μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用12、24及48 h,用免疫荧光法鉴定分化的心肌样细胞α-肌动蛋白表达率,10 μmol/L作用24 h为佳诱导浓度.通过建立流体剪切力模型,设立以下四组:不加载流体剪切力组、加载5 dyn/cm2流体剪切力组、加载15 dyn/cm2流体剪切力组和加载25 dyn/cm2流体剪切力组,作用24 h,倒置显微镜观察诱导后骨髓间充质干细胞形态的变化,4周后逆转录聚合酶链反应测定分化的心肌样细胞心肌肌钙蛋白I mRNA的表达.结果 骨髓间充质干细胞随着传代逐渐变成梭形,5-氮杂胞苷诱导后骨髓间充质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征.免疫荧光显示α-肌动蛋白表达阳性.经过流体剪切力作用细胞后,心肌肌钙蛋白I的表达增高,阳性条带均比未进行力学刺激的细胞表达明显,以15 dyn/cm2剪切力明显.但是25 dyn/cm2剪切力作用结果并没有随着力的增大而增大.结论 5-氮杂胞苷可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,5-氮杂胞苷可联合剪应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,且诱导效果优于单独使用5-氮杂胞苷.
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血流剪切力在微小RNA转运介导的血管稳态调控中的作用
施加于内皮细胞的血流剪切力可调控血管平滑肌细胞的表型，对血管稳态维持和动脉粥样硬化发生有重要影响。但这一力学信号由内皮细胞向平滑肌细胞的传递机制待阐明。前期工作中我们发现microRNA可作为信号分子介导内皮细胞与平滑肌细胞的交互作用。我们推测：作用于内皮细胞的流体剪切力通过诱导流场特异性的microRNA分泌，调控平滑肌基因表达和表型转换以及血管功能。利用体外流体剪应力加载模型、共培养合并流体加载模型、小鼠血流扰流模型等研究系统，我们发现保护血管的层流和损伤血管的扰流可差异性地调控miR－126、miR－143／－145、miR－155等microRNA的分泌；层流抑制miR－126的分泌，扰流则促进其分泌，其机理涉及剪切力对分泌相关蛋白的表达和细胞内转位的调控；内皮细胞分泌的miR－126可促进平滑肌细胞增殖和去分化表型、促进小鼠颈总动脉新生内膜增厚。研究结果确认了胞外microRNA在血管病理生理过程中的作用，增进了对动脉硬化发生机制的了解。
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NFATc1-ERK5通路介导流体剪切力促进成骨细胞BMP7表达
目的:探讨成骨细胞中NFATc1与ERK5调控关系,并研究流体剪切力(FSS)调节BMP7表达的信号通路.方法:实验分为6组,即空白组、FSS组、CsA(Cyclosporin,NFATc1抑制剂)组、XMD8-92(ERK5抑制剂)组、FSS+CsA组、FSS+XMD8-92组.用Western Blot方法检测不同干预条件下NFATc1、ERK5、p-ERK5以及BMP7蛋白表达水平并进行比较.结果:12 dyn/cm2FSS作用45 min能够显著提高NFATc1、p-ERK5在成骨细胞内水平,400 nmol/L CsA干预30 min能够有效抑制NFATc1表达量升高以及ERK5磷酸化,但5 μmol/L XMD8-92作用1 h仅能够抑制ERK5磷酸化,而对NFATc1没有作用.此外,FSS促进MC3T3-E1细胞中BMP7表达量升高,CsA和XMD8-92任何一种抑制剂均能显著阻止BMP7表达.结论:FSS在成骨细胞中通过NFATc1来调控ERK5磷酸化,BMP7为ERK5下游靶点受NFATc1-ERK5通路调控.
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不同加载时间流体剪切力对成骨细胞中基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶抑制剂-1表达的影响
目的:研究加载不同时间流体剪切力对成骨细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP-1)表达的影响.方法:利用自行设计的平行平板流体剪切力加载装置,对MC3T3-E1成骨细胞施加12 dyn/cm2流体剪切力0、15、30、45、60 min,采用蛋白免疫印记实验检测MMP-1和其抑制剂TIMP-1的表达水平.结果:对体外培养的MC3T3-E1细胞加载12 dyn/cm2流体剪切力,随着加载时间的延长,MMP-1表达上调,TIMP-1表达水平下调,在45 min左右达到高峰.结论:加载不同时间的12 dyn/cm2流体剪切力能够上调MC3T3-E1成骨细胞MMP-I的表达,下调TIMP-1的表达,加载45 min合适.
关键词： 流体剪切力 MC3T3-E1细胞 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶抑制剂 -
细胞骨架在流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因和蛋白表达中的作用
目的:探讨细胞骨架在流体剪切力(FSS)诱导成骨细胞COX-2基因和蛋白表达中的作用.方法:将第3代小鼠原代成骨细胞分为4组:对照组、细胞松弛素D(CD)组、FSS组、FSS+CD组.FSS组和FSS+CD组分别施加12 dyne/cm2的FSS 60 min,FSS组只加FSS,而FSS+CD组在加入CD预处理60 min后施加FSS 60 min;对照组不做任何处理;CD组仅加入CD.应用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法和激光共聚焦显微镜检测COX-2 mRNA和蛋白的表达以及肌动蛋白细胞骨架的变化,并对结果进行双因素方差分析.结果:FSS组与其他3组相比,COX-2的mRNA和蛋白表达显著增加(P＜0.05);CD组与对照组及FSS+CD组相比,COX-2的mRNA和蛋白的表达水平无显著差异(P＞0.05);FSS+CD组与FSS组相比,COX-2的mRNA和蛋白的表达水平显著降低(P＜0.05).结论:应用FSS能使成骨细胞骨架发生重排、增多、增密且与流体方向保持一致.细胞骨架微丝的完整性与COX-2基因和蛋白表达密切相关,而CD对COX-2基因和蛋白的表达基本没有影响.
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ER-α-ERK5信号通路介导流体剪切力促进MC3T3-E1细胞增殖
目的:研究雌激素受体α(ER-α)在流体剪切力促进细胞外信号调节激酶5(ERK5)活化以及ER-α-ERK信号通路在成骨细胞增殖中的具体分子机制.方法:给予成骨MC3T3-E1细胞孵育特异性ER-α-抑制剂MPP(methyl-piperidino-pyrazole,1μmol/L),孵育高选择性ERK5活性抑制剂XMD8-92(5 μmol/L),和/或加载12 dyn/cm2流体剪切力处理.采用MTT实验检测成骨细胞的增殖活性,采用蛋白免疫印记实验检测ER-α、P-ERK5、ERK5、CyclinD1(细胞周期蛋白)和CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶)蛋白的表达水平.结果:生理强度(12 dyn/cm2)的流体剪切力作用于成骨MC3T3-E1细胞60 min后能显著促进成骨细胞增殖,促进CyclinD1和CDK4的表达;同时ER-α和P-ERK5的表达显著增加.成骨细胞孵育MPP抑制ER-α后,P-ERK5的表达显著下降,CyclinD1和CDK4表达也显著降低.孵育XMD8-92抑制ERK5活性后,流体剪切力促进成骨细胞中CyclinD1和CDK4表达水平显著下降.结论:流体剪切力通过ER-α-ERK5信号通路上调CyclinD1和CDK4的表达水平,终导致成骨MC3T3-E1细胞增殖.
