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利用巢式聚合酶链反应检测单个胚胎小体细胞中时钟基因的表达
目的 建立一组灵敏的检测时钟基因(clock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况.方法 培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因特异引物进行巢式聚合酶链反应,电泳检测扩增产物,从而建立相应的巢式PCR反应体系.利用膜片钳获取胚胎小体来源的单个细胞,通过巢式PCR反应检测相应时钟基因的表达情况.结果 确定了BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因的扩增参数.证明在此条件下无非特异扩增,并且能够检测到至少两个拷贝的目的分子.利用此检测体系发现,部分胚胎小体细胞中BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2时钟基因环路不完整.结论 巢式PCR方法能够灵敏地、而且特异地从单细胞中检测出一组时钟基因的表达,时钟基因的转录在胚胎小体细胞中并不一致,即时钟基因的环路不完整.时钟基因可能在细胞分化过程中发挥着某种作用.
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体外诱导小鼠胚胎干细胞血管形成
目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞向内皮细胞分化的条件,模拟体内血管生成和血管新生过程,为研究新血管的形成提供一种新思路.方法体外培养小鼠胚胎干细胞诱导形成胚胎小体,将11 d的胚胎小体种植到胶原中诱发出芽性血管新生;通过免疫组织化学染色方法检测胚胎小体及其出芽向内皮细胞和功能血管的分化.结果胚胎干细胞在体外能自发形成胚胎小体,其内部含有血管样结构,并伴有平滑肌的分化;种植到胶原中的胚胎小体能再现出芽性血管新生.结论胚胎干细胞在体外不但能定向分化成内皮细胞,还能再现体内血管生成、血管新生及动脉生成过程.
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胚胎小体来源早期血管新生模型的研究进展
在体胚胎的早期血管发育生物学研究由于受到胚胎体积小、细胞数量少和获取困难等技术难点而制约了其发展.胚胎干细胞的体外培养及其分化为胚胎小体等技术的建立,为早期胚胎血管发生的分子机制研究提供了可视性的研究平台.应用这些技术手段不仅可以观察血管发生早期的生理及病理变化,还使得外源性干预成为可能.本文小结了胚胎小体来源的早期成血管模型的研究,对胚胎小体血管新生分子生物学机制进行了综述.
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胚胎小体在血管发育研究中的应用
胚胎干细胞(ES)可自发地在体外分化成单层细胞或聚集生长成胚胎小体(EB),EB可生成高度分化的细胞.在EB形成过程中,既有血管发生也有血管新生,因此EB系统可以在体外模拟胚胎血管形成的过程,可用于血管发育的研究.
