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Livin在白血病耐药细胞系THP-1R的表达
Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族新成员,在正常组织极少表达,而在多数恶性肿瘤组织细胞中高表达,与肿瘤抗凋亡和耐药性有关[1].为探讨Livin与白血病细胞耐药的相关性,本实验主要从分子水平研究Livin在人急性白血病细胞系THP-1与耐药细胞系THP-1R中的差异表达情况,为Livin在白血病多药耐药( multi-drug resistance,MDR)方面的意义提供实验依据.1材料与方法1.1材料主要试剂:RPMI 1640培养液(Promega公司);兔抗Livin抗体(博奥森生物技术有限公司);引物(上海生工生物工程公司);RT-PCR试剂盒(MBIFermentas公司);双链siRNA和RNAi-Mate转染试剂(上海吉玛生物技术公司).1.2方法1.2.1细胞培养:THP-1细胞为本室冻存,用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5％ CO2条件下培养,2～3d传代1次.采用逐渐增加药物浓度的方法[2]建立THP-1耐Ara-C的耐药系THP-1R,实验前2周撤去药物,以正常的RPM1640培养液培养,然后取对数生长期细胞用于后继实验.1.2.2 siRNA转染:参考文献[1],针对人Livin基因2个异构体的共同部分合成siRNA序列,正义链5’-GACAGUGCC AAGUGCCUGCdTdT-3’,反义链5'-GCAGGCACUUGGCACUG UCdTdT-3’.按照说明书所述比例配制siRNA/RNA-Mate复合物和完全培养基的混合液,用此混合液稀释细胞至所需浓度,再分配到培养板各孔.非转染对照组用生理盐水代替siRNA.同时转染有荧光标记的阴性对照siRNA,在荧光显微镜下观察和判断转染效果.
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三种脂质体法转染试剂转染原代大鼠气道平滑肌细胞效果的比较
气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）是呼吸道的重要组成部分之一，受气道内各类免疫细胞所释放的细胞因子和炎性介质的调节产生相应的收缩，其自身也能够分泌细胞因子、趋化因子、生长因子、黏附分子和基质金属蛋白酶等，参与气道炎症、气道高反应性与气道重塑的发生发展，是研究哮喘、COPD 等气道呼吸性疾病细胞分子机制的重要载体[1]。国内外研究中使用的 ASMCs 大多从活组织（比如动物气管、支气管和活检样品等）中分离并原代培养获得，这比细胞系更能准确地模拟来源组织在体内环境的特异性特征。
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外源性 Nkx2.5、GATA4促进大鼠骨髓间充质干细胞的心肌分化
目的：：心脏早期转录因子Nkx2.5、GATA4转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨Nkx2.5、GATA4对大鼠BMSCs向心肌细胞分化的作用和影响。方法：全骨髓法分离、纯化、扩增培养SD大鼠BM-SCs,流式细胞术联合检测第三代细胞表面分子,CD90+/CD29+/CD45-细胞达95%以上。采用阳离子转染试剂LipofectamineTM2000将pEGFP-N1-Nkx2.5、pVP22-GATA4/myc-His质粒转染BMSCs。结果：转染4周后,Western blotting、免疫细胞化学结果表明,与空质粒组、空白对照组相比,Nkx2.5、GATA4显著提高转染组大鼠心肌细胞肌钙蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)、连接蛋白43(connexin43, Cx43)的表达。免疫细胞化学结果显示Nkx2.5转染组、GATA4转染组中部分细胞呈cTnT、Cx43阳性,cTnT阳性细胞的胞质中可见棕黄色丝网状及颗粒样结构,Cx43阳性细胞的细胞质中可见棕褐色颗粒。透射电镜观察各组细胞超微结构变化,转染组大鼠心肌细胞的细胞质内出现大量平行排列的肌丝样结构,细胞侧面或细胞末端可见较多缝隙连接。结论：外源性Nkx2.5、GATA4能够促进BMSCs向心肌细胞分化。
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内毒素相关受体基因共转染肠上皮细胞的研究
基因转染可将目的基因导入靶细胞进行基因功能和基因表达调控的研究 [1].但转染效率的高低受诸多因素的影响,尤其是多种功能相关基因的共转染,更加困难.既往研究发现,人肠上皮细胞株(HIC)不表达内毒素(LPS)相关受体CD14(cluster of differentiation 14)、Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)和MD-2 (myeloid differentiation protein-2).为进一步证实这3种LPS相关受体的不表达是否是肠上皮细胞耐受LPS的关键机制,我们用FuGENE 6转染试剂进行CD14、TLR4和MD-2基因共转染人肠上皮细胞的探索.
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转染试剂及幽门螺杆菌对AGS细胞形态的影响
目的:探讨不同的转染试剂对AGS细胞形态的影响,观察这些转染试剂能否像幽门螺杆菌那样引起AGS细胞蜂鸟状改变.方法:用多聚阳离子转染试剂(多聚乙酰亚胺、梭华-Sofast)和改良的脂类转染试剂(Effectene Transfection Reagent)分别转染AGS细胞,观察细胞形态的变化.用幽门螺杆菌26695菌株攻击AGS细胞,观察细胞形态的变化并与经转染试剂作用的细胞进行形态比较.结果:幽门螺杆菌攻击后4 h能引起AGS细胞发生蜂鸟状改变.两种多聚阳离子转染试剂也均能引起AGS细胞发生蜂鸟状改变,与幽门螺杆菌引起的细胞形态改变相似,大部分细胞拉长,并且不受是否转染DNA的影响.此种变化在转染4 h时便出现,与试剂剂量的增加呈正相关.当PEI的剂量为10 μL时,细胞出现凋亡,15μL时凋亡加重.改良的脂类转染试剂对AGS细胞的形态未产生影响.结论:在研究引起AGS细胞形态改变的因素时,不宜选择多聚阳离子转染试剂;多聚阳离子引起的AGS细胞形态改变与幽门螺杆菌引起的AGS细胞形态改变之间是否存在关系值得进一步研究.
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丙型肝炎病毒核心蛋白上调NIP3基因表达研究
目的:了解丙型肝炎病毒核心蛋白和NIP3基因的表达的关系,研究HCV核心蛋白在HCV致病的分子生物学机制中的作用.方法:聚合酶链反应(PCR)扩增NIP3基因启动子,以T-A克隆法,将NIPP基因片段连入载体pGEM-T.获得的质粒pT-NIPP,和报告质粒pCAT3-basic分别用SacI和Bg1Ⅱ双酶切后构建报告载体pCAT3-NIPP,分别以重组报告载体pCAT3-NIPP和pcDNA3.1(-)-core应用FuGENE 6转染试剂瞬时转染NIH3T3细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.应用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HCV核心蛋白对NIP3基因启动子的反式激活作用.结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-core和报告载体pCAT3-NIPP经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-NIPP和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染的NIH3T3细胞中的CAT表达活性为pCAT3-NIPP的1.9倍,是pCAT3 basic的3.6倍,明显升高.结论:丙型肝炎病毒核心蛋白可反式激活NIP3基因启动子,进而上调NIP3基因的表达.
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两种转染试剂转染重组质粒至Caco-2细胞转染效率的比较
目的 比较两种转染试剂Lipofectamine LTX&PLUS和罗氏X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染重组质粒至Caco-2细胞的转染效率. 方法 分别采用Lipofectamine LTX & PLUS转染试剂与罗氏X-tremeGENE HP转染试剂转染Caco-2细胞,以荧光素酶(Luc)和绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,利用荧光信号检测仪检测荧光信号,Lipofectamine LTX和质粒的比值分别为4∶1,3. 5∶1,2∶1,罗氏X-HP与质粒的比值分别为3∶1,2∶1,1∶1,对转染试剂和质粒DNA之间的比值进行优化,然后比较两种转染试剂的转染效率;荧光倒置显微镜观察转染效果. 结果 对于Caco-2细胞,两种转染试剂均未影响细胞的正常形态,细胞毒性小.罗氏X-HP转染试剂与DNA质粒的比例是3∶1时转染效率较高(P＜0. 05),LTX转染试剂与DNA质粒的比例为3. 5∶1时转染条件佳(P＜0. 05).比较两者的转染效率,罗氏转染试剂(Firefly RLU/Renilla RLU＝0. 667)高于LTX转染试剂(Firefly RLU/Renilla RLU＝0. 502)(P＜0. 05). 结论 不同的转染试剂对相同细胞的转染效率不同.相比较而言,罗氏转染试剂对于Caco-2细胞的转染更为合适.
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不同转染试剂对制备CAR-T细胞的病毒包装效果比较
目的 为提高制备嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)的病毒包装滴度,比较并确定有效的病毒包装转染试剂.方法 应用氯化钙(CaCl2)、TransintroTM EL、脂质体Lip2000三种质粒转染试剂对逆转录病毒载体质粒MSCV-IRES-GFP(MIG1)、含嵌合抗原受体(CAR)及HA标签的逆转录病毒载体质粒MSCV-IRES(MIG2)、真核表达质粒pIRES2EGFP-DDR1(PDDR1)进行转染,荧光显微镜观察、流式细胞检测上述试剂的转染效率.结果 TransintroTM EL均获得相对较高的转染效率,对MIG1为(43.90±0.57)％,对MIG2为(42.80±0.57)％,对PDDR1为(58.90±0.71)％.而脂质体Lip2000的转染效率均相对较低,对MIG1为(5.20±0.42)％,对MIG2为(9.75±0.07)％,对PDDR1为(22.4±0.28)％.CaCl2在同一转染体系下对不同质粒转染效果不同.结论 对于制备CAR-T细胞的病毒包装,TransintroTM EL试剂能够稳定获得较高的转染效率.
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三种转染试剂对人脑胶质瘤细胞U251的作用
目的:研究转染试剂Lipofectin、DOTAP和FuGENE 6介导反义c-myc基因转染人脑胶质瘤细胞U251的作用.方法:将可在真核细胞表达人反义c-myc基因的质粒pCED4ASCMH分别与转染试剂Lipofectin、DOTAP和FuGENE6结合,转染到人脑胶质瘤细胞U251中,转染的第24,48,72和96小时用MTT比色法检测细胞活性并进行比较.结果:转染实验组较对照组细胞活性均降低30%～40%.结论:三种转染试剂介导反义c-myc基因质粒DNA转染U251细胞具有抑制细胞增殖、降低细胞活性、促进细胞死亡的作用.
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HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达
1. 材料与方法：乳哺动物细胞表达载体pBK-CMV，长约4.5kb，带有T7公用序列。pCP10是pBR322 EcoRI位点中插入双拷贝头尾相接的HBV ayw亚型全基因HBV DNA重组质粒。PCR引物XI1：1428-1448 nt 5′CGT CCC GTC GGC GCT GAA TCC 3′，XI2：1672-1653 nt 5′AGT CCA AGA GTC CTC TTA AG 3′。人肝癌细胞系SMMC-7721，由上海细胞所提供。将EcoRⅠ酶切后回收的全基因HBV片段，在T4 DNA连接酶作用下，与EcoRⅠ酶切后的pBK-CMV粘端连接。利用pBK-CMV具有T7公用序列，选用XI2、T7作为引物，PCR出现1.7kb阳性条带为反接，并命名为pBK-AHBV。用FUGENETM6转染试剂转染SMMC-7721细胞。在含10%FCS的RPMI 1640（pH7.4）培养基中培养至60h后，用总RNA抽提试剂（Trizol Reagent）提取转染的SMMC-7721细胞，依次获得总RNA、DNA。
