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p21活化激酶2在爪蟾卵母细胞的细胞质分裂过程中的作用
目的 研究p21活化激酶2(PAK2)在爪蟾卵母细胞的细胞质分裂中的作用.方法 以爪蟾卵母细胞为模型,利用特异性抑制PAK2活性的PAK2-N端(PAK2-NT)片段,显微注射爪蟾卵母细胞.荧光显微镜下比较PAK2-NT mRNA注射组和对照组卵母细胞生发泡破裂的发生.激光扫描共焦显微镜下,时间延迟摄影法观察两组卵母细胞的细胞质分裂过程中肌动蛋白和纺锤体的变化.结果 PAK2-NT mRNA注射组卵母细胞与对照组卵母细胞生发泡破裂发生相似,但PAK2-NT mRNA注射组卵母细胞未见细胞质分裂.结论 PAK2可能参与爪蟾卵母细胞的细胞质分裂过程.
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异源性表达载体--爪蟾卵母细胞的内源性离子通道
作为异源性表达载体,非洲爪蟾卵母细胞用于各种蛋白的表达,包括受体、离子通道、转运体等,为研究所表达蛋白的结构、功能及药理学特性提供了重要的手段,已在生命科学研究领域内得到了广泛的应用.本文就近年来对爪蟾卵母细胞内源性离子通道的研究进展作一综述,以期对全面、客观的解释和评价爪蟾卵母细胞所表达的异源性离子通道的研究结果提供帮助.
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MAPK及其相关分子在卵母细胞减数分裂中作用的研究进展
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,广泛分布在雌性和雄性动物的生殖细胞中[1],可在多种不同的信号转导途径中充当一种共同的信号转导成分,且在细胞周期调控中发挥重要的作用.目前MAPK家族中有4个成员已被纯化和深入研究,如p42MAPK,p44ERK1,p54MAPK及p44MAPK,在爪蟾、小鼠、猪、山羊、牛、大鼠、马、和人的卵母细胞中都有发现.该文对MAPK家族分子在卵母细胞减数分裂中的作用的研究进展进行综述.
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卵泡抑素在爪蟾胚胎发育过程中的时空表达模式及在早期心形成过程中的作用
目的:研究爪蟾胚胎发育过程中卵泡抑素基因的时空表达模式及其在心形成过程中的作用.方法:收集发育过程中从第10～32期不同阶段的胚胎,MEMPHA固定并进行胚胎整体原位杂交.切下发育第14期形成心的胚胎组织加入卵泡抑素进行培养,检查了早期心形成过程中的转录因子及特异性标记物Nkx2.5的变化.利用Morpholin Oligo技术减弱卵泡抑素表达,也检查了Nkx2.5的变化.结果:在胚胎发育过程中卵泡抑素开始表达在脊索前中胚层和脊索中胚层.随着发育的进行,卵泡抑素的表达覆盖了脑和整个脊索.另外,卵泡抑素也表达在前肾、心形成区和血岛；过量或缺乏卵泡抑素均影响心形成区Nkx2.5的表达.结论:卵泡抑素参与胚胎早期神经系统、前肾、心和血岛的形成并在心的形成过程中起了十分重要的作用.
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视黄酸通过降低心转录因子Tbx20的表达抑制早期心的形成
目的:研究过量视黄酸抑制爪蟾早期心形成的机制.方法:用过量视黄酸培养发育到第14期的胚胎.4h后,胚胎用MEMPHA固定进行转录因子Tbx20的胚胎整体原位杂交.取发育第14期胚胎形成心的组织,并分别加入视黄酸和骨形成蛋白进行培养.4h时后,用MEMPHA固定并进行Tbx20的胚胎整体原位杂交.结果:视黄酸降低Tbx20在早期心组织中的表达；在早期心组织中骨形成蛋白阻止了视黄酸对Tbx20表达的抑制作用.结论:过量视黄酸通过降低Tbx20的表达,抑制了爪蟾心的形成.
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卵泡抑素参与了视黄酸抑制早期心的形成
目的:研究过量视黄酸抑制爪蟾早期心形成的机制.方法:加入过量视黄酸和视黄酸抑制剂AGN194301到发育第14期的胚胎.4h后,胚胎用MEMPHA固定进行胚胎整体原位杂交.取发育第14期胚胎形成心的组织,并分别加入视黄酸、视黄酸抑制剂、卵泡抑素、骨形成蛋白和活化素进行培养.4h后,用MEMPHA固定并进行胚胎整体原位杂交.结果:视黄酸增加了卵泡抑素在早期心组织中的表达;卵泡抑素抑制心的形成.结论:过量视黄酸通过增加卵泡抑素在早期心中的表达抑制爪蟾心的形成.
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卵泡抑素参与爪蟾心的形成
目的:研究卵泡抑素在爪蟾心形成过程中的作用.方法:切下发育第14期胚胎形成心的组织,并分别加入卵泡抑素、骨形成蛋白和活化素进行培养.4 h时后,用MEMPHA固定并进行胚胎整体原位杂交.利用Morpholio Oligo技术减弱了卵泡抑素的表达,检测了在缺乏卵泡抑素条件下心形成的变化.结果:早期心表达卵泡抑素;增加或降低卵泡抑素均抑制Nkx 2.5的表达.结论:卵泡抑素在心的形成过程中发挥十分重要的作用,缺乏或过量卵泡抑素均影响心的形成.
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爪蟾顶盖神经元的大微抑制性突触后电流(mIPSCs)依赖从钙储池释放的钙?
目的用影响突触前细胞外钙内流及或细胞内钙储池释放钙的措施,研究大、小微抑制性突触后电流(mIPSCs)的一些特性.方法采用盲法电压钳全细胞记录技术.结果①无钙液中加或不加EGTA(200 mmol/L)灌流时,均可逆地使大mIPSCs较正常含钙液灌流时明显增多,小mIPSCs的平均频率明显下降;增加细胞外液钙(4 mmol/L)浓度,小mIPSCs的频率增加,大mIPSCs变化不明显.Cd2+(100 μmol/L),仅轻度降低小mIPSCs平均频率至对照组的(87.3±30.0)%(n=13).②carbachol(100 μmol/L)使小mIPSCs增加至对照组的315.63%.然而,无钙液中加carbachol,小mIPSCs不增加.含钙液和无钙液中加carbachol均可使大mIPSCs的比例增加.③Thapsigargin(8 μmol/L)可使小mIPSCs的平均频率增加至对照组的(132.1±27.4)%.④U73122(40μmol/L)可使小mIPSCs的平均频率降低至对照组的(74.7±29.6)%.⑤Procaine(2 mmol/L)及咖啡因(10 mmol/L)均可降低小mIPSC的平均频率.较高浓度的兰尼定(30-50 μmol/L)也降低小mIPSCs的频率.结论改变灌流液的钙浓度,小mIPSCs的频率受到明显影响.大mIPSCs的出现或增加主要与钙储池释放Ca2+的机制有关.
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爪蟾视觉发育过程中抑制性GABAa受体功能的变化
目的:阐明从幼年(变态脱尾后2～12周)到成年(变态脱尾后5～10月)爪蟾的视顶盖神经元突触受体变化.方法:盲法脑片全细胞电压钳技术.结果:成年视顶盖神经元的微抑制性突触后电流(mIPSCs)的发放频率(Hz)和平均振幅(pA)分别为2.65±0.69和9.82±1.30,而幼年的分别为0.68±0.23和15.36±2.40,其中成年动物的mIPSCs的频率是幼年频率的3.90倍;乙酰胆碱受体(nAChR)激动剂carbachol均可使幼年及成年的mIPSCs频率增加,增强效率有所不同,幼年增加至对照组的192.0%,而成年组仅为146.2%.结论:随着视顶盖神经元的成熟,其突触GABAa受体功能也相应增强.
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爪蟾卵母细胞表达体系在功能基因组学研究中的应用
非洲爪蟾卵母细胞表达体系是一种功能强大、适用范围广的表达体系,同时,也是应用早的表达体系之一.随着分子生物学的发展,以及检测技术的进步,其应用有了进一步的扩展,不同种类、不同功能的蛋白质均可以在其中表达,同时进行功能研究.本文着重介绍爪蟾卵母细胞的生物学特性,对于不同功能的蛋白质的表达及功能的研究,以及在功能基因组研究中的应用.
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胞内精子注射法制备转基因爪蟾的研究
目的研究爪蟾胞内精子注射法(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)转基因技术的可行性.方法取成熟雄蛙的睾丸分离纯化精子,用毛地黄皂甙(digitonin)崩解精细胞膜并制备精子浓缩液,然后与线性化报告基因载体pCMV-EGFP-N1共处理,后将处理后的精子注射入从雌性爪蟾体内取出的未受精卵中,培养并观察.结果制备的精子质量较高,稀释的精子注射人未受精卵后,卵的受精率为10%,受精卵活过神经胚的比率为20%,但都略微有点畸形.其中,绿色荧光报告基因EGFP的整合率为81%,但镜下未见绿色荧光蛋白的表达.结论ICSI法是制备转基因爪蟾的简便可行的新途径.
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细胞外Zn2+对内向整流钾通道的阻断作用
目的研究细胞外Zn2+对非洲爪蟾卵母细胞表达的内向整流钾通道 (IRK1)的阻断作用. 方法采用双微电极电压钳(TEV)法. 结果细胞外 Zn2+浓度分别为0, 0.1, 0.25, 1, 3 , 10和20 mmol*L-1,K+浓度为90 mmol*L-1时,可见Zn2+对IRK1的瞬间电流(施加电压后2 m s)具有Zn2+浓度依赖性、时间依赖性和电压依赖性阻断作用;阻断剂Zn2+对IR K1的门控特性和外向电流几乎无影响作用;细胞外加Zn2+后反转电位没有变化,因而IRK1对之不通透; 细胞外Zn2+可增加IRK1的归一化电导. 三级指数拟合的结果提示:细胞外Zn2+ 对IRK1的抑制作用可能通过表面电荷机制或通过阻断通道表面位点. 因为Zn2+浓度较低时,阻断大小与Zn2+ 浓度时差异不大,所以Zn2+不会通过表面电荷机制进行IRK1阻断的. 结论 Zn2+是IRK1的一种快速开放通道阻断剂,其阻断位点在通道表面.
