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先天性肠无神经节细胞症患儿中血清维生素A及肠组织维甲酸受体α和HA117的表达特点
目的 检测先天性肠无神经节细胞症(HD)患儿中血清维生素A及肠组织维甲酸受体α(RARα)、抗分化长链非编码RNA(LncRNA) HA117的表达特点,探讨其与HD发病机制的可能联系.方法 收取17例临床诊断为HD的患儿术前外周血及手术结肠组织标本,结肠组织由近端至远端分为3组:吻合口组、扩张段组和痉挛段组.检测血清维生素A浓度,采用Real-time PCR、免疫组织化学染色、Western blotting方法检测RARα及HA117在各组结肠组织的表达水平.结果 17例HD患儿均有不同程度维生素A缺乏,血清维生素A平均浓度为(0.73±0.05) μmol/L.在吻合口段,RARα在肌间神经丛可见棕黄色的阳性染色,而在痉挛段几乎未见阳性神经丛染色;在吻合口组、扩张段组和痉挛段组,RARα mRNA相对表达量依次为3.62±1.12、1.81±0.69、0.65±0.32,与吻合口相比,痉挛段表达量降低(P＜0.05,n=17);HA117mRNA相对表达量依次为0.47±0.15、1.25±0.40、2.57±0.70,与吻合口相比,痉挛段表达量增高(P ＜0.001,n=17);RARα蛋白相对表达量依次为1.16±0.05、0.99±0.05、0.88±0.04,与吻合口相比,扩张段及痉挛段表达量降低(分别为P＜0.05、P＜0.001,n=17).结论 维生素A、RARα及HA117可能共同参与肠神经系统(ENS)的发育过程;其中,维生素A和RARα可能促进了ENS的正常分化发育,而高表达的HA117可能对抗了前者的促分化作用,阻碍了ENS正常分化发育过程,进而导致HD的发生.
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过量维甲酸对金黄地鼠胚胎神经管维甲酸受体α表达的影响
目的:探讨过量维甲酸(RA)对金黄地鼠胚胎神经管维甲酸受体α(RARα)基因和蛋白表达的影响.方法:采用原位杂交和免疫组织化学方法及图像分析,半定量分析金黄地鼠胚胎神经管正常发生及RA致神经管畸形过程中RARα转录和表达水平的变化.结果:正常对照组RARα表达水平随胚龄增加而逐渐下降.实验组在灌服过量RA后3h,RARα表达水平明显低于正常对照组;6h时其表达水平明显高于正常对照组;14、22、46h其表达水平下降,与对照组相比无显著差异;96h其表达增强,并显著高于对照组水平.结论:过量RA引起的RARα转录和表达水平的变化与RA致金黄地鼠神经管畸形有关.
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微核糖核酸506在人结肠癌细胞中的靶基因预测和鉴定
目的 预测并验证微核糖核酸506(miR-506)的真实靶基因.方法 通过多个生物信息学软件对miR-506可能调控的靶基因进行预测,结合其生物学功能和前期基因芯片结果,确定候选靶基因.根据miR-506结合候选靶基因的3'UTR位点,构建相应的报告基因载体及突变体.将所构建的报告基因载体或突变体、β半乳糖苷酶对照报告酶载体和miR-506前体共转染至SW1116细胞中,24 h后检测荧光报告酶变化.结果 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和维甲酸受体(RXR)α皆为has-miR-506的可能靶基因,miR-506作用于PPARα基因3'UTR区可能存在3个位点,RXRa基因3'UTR区可能存在2个位点.针对于PPARα基因的三组报告基因载体中,位点7930-7936组变化为明显[(2.68±0.55)倍],位点3547-3553组和位点8335-8341组的荧光报告酶表达变化为其突变体的(1.43±0.22)倍和(1.34±0.20)倍.针对于RXRa基因的两组报告基因载体的荧光报告酶变化则并不显著.结论 PPARα为miR-506的真实靶基因,而RXRα非miR-506的靶基因.
关键词： 结肠肿瘤 微核糖核酸506 过氧化物酶体增殖物激活受体α 维甲酸受体α 靶基因 -
急性早幼粒细胞白血病患者血肿瘤细胞NLS-RARα蛋白的表达与定位
目的 验证急性早幼粒细胞白血病(APL)患者血肿瘤细胞中带核定位信号的维甲酸受体α(nuclear localization signal-retinoic acid receptor alpha,NLS-RARα)蛋白的存在及定位.方法 采用蛋白质印迹法验证患者血肿瘤细胞中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)的存在;提取患者血肿瘤细胞核蛋白,蛋白质印迹法检测细胞核中NLS-RARα蛋白的表达;FITC/DAPI双染色免疫荧光法检测患者血肿瘤细胞中NLS-RARα的表达及定位;FITC/PI双染色激光共聚焦法检测患者血肿瘤细胞中NLS-RARα的表达及定位.以重组腺病毒Ad-NE感染的NB4细胞中NLS-RARα蛋白的表达及定位作阳性对照,以正常人血中性粒细胞中野生型RARα的表达和定位作阴性对照.结果 阳性对照组设置成功.APL患者血肿瘤细胞中存在NE且有NLS RARα蛋白表达.细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测结果提示APL患者血肿瘤细胞NLS-RARα蛋白的表达主要位于胞核.结论 成功用3种方法检测出APL患者血肿瘤细胞中NLS-RARα蛋白的存在并推测其定位,为进一步研究APL的早期诊断及复发监测提供了新思路.
关键词： 维甲酸受体α 核定位信号 中性粒细胞 急性早幼粒细胞白血病 -
带核定位信号的RARα与谷氨酸氨连接酶蛋白相互作用的胞内外验证
目的 通过胞内外实验验证谷氨酸氨连接酶(GLUL)与带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)之间的相互作用.方法 将表达GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白的两种重组表达质粒共同转化入AH109酵母菌,采用一对一的酵母双杂交技术验证它们在活细胞内的相互作用;通过构建GLUL及NLS-RARα蛋白标签融合表达载体,共转染至人胚肾HEK 293细胞,利用免疫共沉淀技术在细胞外验证它们之间的相互作用.结果 GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色的阳性克隆;GLUL蛋白及NLS-RARα标签融合表达载体构建成功,共同转染至HEK293细胞,采用抗HA多克隆抗体免疫沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,抗c-Myc单克隆抗体免疫印迹检测,检测到GLUL-cMyc蛋白.结论 采用酵母双杂交和免疫共沉淀技术成功地在胞内外验证了GLUL与NLS-RARα之间存在特异性的相互作用.
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FRAP技术揭示PLZF-RARα融合蛋白在细胞核内的运动性依赖于其配基及转录活性
目的 运用光漂白荧光恢复(FRAP)技术检测一系列带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的野生型及突变型的早幼粒细胞性白血病锌指-维甲酸受体α(PLZF-RARα)表达蛋白分子在细胞核内运动性.方法 运用凝胶迁移实验(EMSA)检测带有GFP标签的野生型及突变型PLZF-RARα融合蛋白结合维甲酸反应元件(RARE)的能力;运用FRAP以及共聚焦荧光显微镜分析一系列GFP-PLZF-RARα及其突变体表达蛋白在细胞核内的运动性;运用转录抑制剂放线菌素D (Act D)和/或全/式维甲酸(ATRA)处理GFP-RARα和GFP-PLZF-RARα表达细胞,运用FRAP观察PLZF-RARα和野生型RARα在细胞核内的运动性变化情况.结果 位于PLZF结构区的POZ以及锌指结构域不仅是引起PLZF-RARα核内运动性降低的主要原因,同时也是引起配体诱导的核内运动性减慢的关键因素.Act D能够显著地抑制PLZF-RARα和RARα蛋白分子在细胞核内的运动性;分化诱导剂ATRA处理可逆转Act D引起的RARα核内运动性降低效应,但经Act D处理的PLZF-RARα分子无此效应.结论 运用FRAP技术发现PLZF-RARα融合蛋白在细胞核内的运动性减慢可能依赖于配体的存在及其转录活性.
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脂多糖对培养的A549细胞SP-B分泌的影响及其机制
目的 检测在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用下,A549细胞中SP-B、NFкB、RARα表达情况,探讨感染因素(脂多糖)对SP-B表达及其有关调节因素(RARα)表达的影响,并观察在此过程中是否有NFкB表达的改变.方法 培养的A549细胞分为对照组和实验组,实验组分别用不同浓度的脂多糖处理24 h.免疫细胞化学法检测SP-B和RARα在各组A549细胞中的表达情况,免疫荧光共聚焦法检测NFкB在各组A549细胞中的表达变化.结果 各实验组SP-B的表达均较对照组减弱(P<0.01),且呈药物浓度依赖性(P<0.05).各实验组胞核内RARα表达均较对照组减弱(P<0.01),且呈明显的药物浓度依赖性(P<0.01).而各实验组胞质RARα表达均较对照组增强(P<0.01),也呈药物浓度依赖性(P<0.01).与对照组相比,实验组中NFкB部分转位至A549细胞胞核中表达.结论 脂多糖作用后,A549细胞中SP-B的表达减少,且NFκB和RARα在细胞内的分布都发生了变化,表明在呼吸窘迫综合征的发病中,炎症过程可能起到重要作用,NFκB和RARα可能在此阶段中都参与了SP-B表达调控.
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先天性肛门直肠畸形患儿血清VA及肠组织RARα表达及意义
目的 检测先天性肛门直肠畸形(congenital anorectal malformation,ARM)患儿血清维生素A(vitamin A,VA)水平及肠组织维甲酸受体α(retinoic acid receptor α,RARα)的表达特点,探讨其与ARM肠神经系统(enteric nervous system,ENS)异常的可能联系.方法 利用高效液相色谱法检测32例初诊ARM新生儿血清VA浓度,选取30例非消化道畸形新生儿血清作为对照;收集30例ARM患儿直肠末端及造瘘口横结肠组织,选取4例非消化道畸形患儿直肠组织作为对照,RT-PCR检测各组肠组织RARα mRNA表达水平;根据患儿直肠末端病理检查结果将直肠组织分为神经节细胞发育正常组和异常组(n=6),免疫组织化学染色和Western blot检测两组直肠RARα蛋白的表达水平.结果 ARM新生儿血清VA平均浓度显著低于对照组(0.40±0.14μmoL/L vs0.54±0.10 μmoL/L,P＜0.01);ARM患儿直肠末端RARα mRNA表达水平(0.78 ±0.40)显著低于造瘘口横结肠(1.28 ±0.72,P＜0.01)和正常对照组直肠组织(1.12 ±0.14,P＜0.01),而造瘘口横结肠与正常对照组直肠无显著性差异(P＞0.05);RARα蛋白在直肠神经纤维和神经节细胞核呈阳性表达,神经节细胞发育异常组直肠RARα蛋白表达水平显著低于正常组(0.77-±0.08 vs 1.03 ±0.06,P＜0.01).结论 ARM患儿存在血清VA及直肠组织RARα表达异常.
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早幼粒细胞白血病基因的功能研究进展
为了解早幼粒白血病基因和维甲酸受体α(promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor α,PML-RARα)的致病机理,对野生型PML基因的生物学功能的研究进展进行综述.从近年来国内外公开发表的有关报道,结合本研究所的部分研究结果,提示PML的高表达有抑制细胞生长和诱导凋亡的作用;PML可能参与基因表达的调控;且PML功能的发挥与其3个重要功能区和核内定位有关;PML与APL发病有关.表明PML具有多重生物学活性.
关键词： 早幼粒细胞白血病基因 维甲酸受体α 生物学功能 研究进展
