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微囊化施万细胞异种移植对大鼠脊髓损伤修复的影响
在无菌条件下取日本大耳兔坐骨神经,经胰酶消化、低速离心后制成细胞悬液,置RPWⅠ 1640培养基中培养,差速贴壁法分离纯化.倒置显微镜下观察,免疫组织化学检测S-100、NGF,证实为施万细胞.
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神经干细胞移植对大鼠全横断性脊髓损伤修复的影响
我们先前探讨了移植的神经干细胞在大鼠半横断损伤脊髓内存活及分化的情况,结果表明神经干细胞在损伤脊髓内可以存活、迁移并分化为神经元和星型胶质细胞.在此基础上,本研究应用神经干细胞移植,观察其对大鼠全横断性脊髓损伤后结构与功能的影响.取SD新生大鼠海马,剪碎后,用胰酶消化,制成细胞悬液,用含B27和bFGF的DMEM/F12培养液进行培养.神经干细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,5～6!d形成克隆球,7～9!d后进行传代.
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小鼠Lewis肺癌胸膜转移模型建立
肺癌一旦确诊,70%已届中晚期,但是目前没有理想的和肺癌发展进程一致的模型,尤其是晚期肿瘤模型.传统的方法是将肿瘤移植到动物皮下或采用导管移植到支气管内,但是不能很好地模拟晚期临床特征,如呼吸困难、胸水等.我们采用C57BL纯系小鼠Lewis肺癌细胞胸腔内注射和皮下移植比较,具体方法是取生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤组织,制备成0.5×106/ml细胞悬液,采用26号细针穿过小鼠腋前线第6肋间,每只胸腔注射0.2 ml,小心快速操作,避免损伤肺脏.该模型在接种第4 d胸腔胸膜有转移结节,第7 d纵隔胸膜出现淋巴结转移,第11 d心包膜出现转移结节和胸腔积液.全部模型接种成功率100%,中位数生存时间16.5(13～22)d.胸腔注射模型组的生存期范围离散程度小,病程中呼吸困难、体重下降、摄食减少、恶病质发生较多,20%小鼠在第11 d出现胸腔积液.通过药物治疗观察可以更好地反映药物治疗效果,为评价药物治疗提供了有用模型,而且操作简单、造价低廉.
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间皮瘤相关特异性抗体的研究进展
自1979年Singh等[1]用培养的人反应性间皮细胞悬液作免疫原制备多克隆抗间皮细胞抗体以来,陆续用人恶性间皮瘤(MM)细胞株研制了MAb45,anti-MS和ME1等抗体.另外,识别卵巢肿瘤抗原的抗体OV632和K1及抗维尔姆斯瘤抗体anfi-WF1,在MM中亦有较高的敏感性和特异性.
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从组织切片上分离单个细胞的相关技术及其应用前景
1 从组织切片上分离单细胞方法的建立从组织切片上进行单个细胞分离,并扩增出靶DNA片段的技术是1993年由德国科隆大学的Hansmann等[1]建立起来的一项新技术,并将其称为分子组织学技术(molecular histology).该方法的大优点在于能够针对所需研究的细胞,将组织形态和分子生物学技术密切结合,特别适用于细胞组成复杂的病变.同年,Trumper等用霍奇金病(HD)淋巴结制备细胞悬液,结合免疫组织化学,用微操纵器从细胞悬液中提取单个Reed-Sternberg(RS)细胞,并成功地进行了聚合酶链反应(PCR)[3].两种方法相比较,前者更具优势,因为从组织切片上提取单个细胞,能密切结合形态学特征,更为直观和准确,同时也能将目的细胞与周围微环境中的背景细胞作相关性研究.获得单个细胞还有其他方法,如流式细胞仪、密度梯度离心、高梯度磁性细胞筛选,但细胞体积较大时,这些方法易导致细胞碎裂,而从组织切片上提取单个细胞不存在类似问题[4].
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人化SCID小鼠对肝癌抗原的体液免疫应答
为了较真实地反应人体内免疫系统对肝癌抗原的免疫应答,我们选择了SCID小鼠作为模型.实验选择4~12周龄SCID小鼠(免疫缺陷特性稳定),用人胎肝和胸腺细胞悬液(2×107只)经腹腔注途径主用适量(500U/只)IL-2诱导,对其进行了免疫重建.
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野生型P53基因对肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响
目的:观察野生型p53基因对昆明鼠肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响,探讨p53基因的抑瘤机制.方法:♂5周龄昆明鼠30只,随机分类肝癌组(Ⅰ)和p53基因治疗组(Ⅱ).每只鼠于后肢股部皮下接种Hep-A-22肝癌细胞悬液0.2 mL,建立动物模型.接种后24 h,Ⅱ组实验动物于荷瘤局部皮下注射介导野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒液0.2 mL,14 d后处死实验动物.PCR-ELISA定量检测肝癌组织端粒酶活性,免疫组化观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达情况.结果:腺病毒介导的野生型p53基因能够显著抱制肝癌的生长(肿瘤直径23.32±1.45 cm vs5.13±0.37 cm,P＜0.001),明显降低端粒酶的活性表达(A值2.46±0.35vs0.78±0.06,P＜0.01),下调Bcl-2基因蛋白的生成(表达阳性率67.8%vs 25.9%,P＜0.05).结论:野生型p53基因从抑制肝瘤细胞增生,促进肿瘤细胞凋亡两个方面发挥抑癌功能.
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IL-2联合IL-12激活A-NK细胞治疗人肝癌HepG-2
目的:研究A-NK细胞体外抗肿瘤作用及小鼠体内抗肿瘤作用.方法:用淋巴细胞分离液分离健康人外周血中的血单个核细胞,PME(5 mmoL/L)室温处理40 min,PME处理后的人外周血单个核细胞重悬于AIMV中.分为四组分别为:IL-2(6 MU/L)组,IL-2(1MU/L)组,IL-12(5 ug/L)组,IL-2(1 MU/L)+IL-12(5 ug/L)组;每瓶细胞浓度为5×109/L,于37℃,50 mL/L CO2饱和湿化空气的培养箱中水平培养4-5 h,移去含未黏附于塑料表面的细胞悬液,收集黏附于塑料表面的细胞(即A-NK细胞),MTT比色法检测A-NK细胞体外细胞毒作用;然后建立肝癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,以肿瘤体积、抑瘤率、生存期等指标观察A-NK对移植瘤的抑制作用.结果:A-NK+IL-2+IL-12组细胞毒活性明显高于其他三组(aP＜0.05),体内实验表明A-NK+IL-2+EL-4/IL-12治疗组的移植瘤生长速度缓慢,体积明显小于生理盐水对照组(bP＜0.05),生存期显著延长(cP＜0.05).结论:IL-12辅助IL-2激活的A-NK细胞的体外杀伤活性较单独用IL-2或IL-12强,体内实验显示具有明显的抗肿瘤作用.
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白藜芦醇合用5-FU对小鼠移植肝癌H22生长的影响
目的:测定白藜芦醇合用5-FU对小鼠移植肝癌H22生长及其毒性的影响方法:将含1.0×109的肝癌细胞悬液0.2mL,接种在6只Balb/c小鼠腹腔.5d-7d后,抽取小鼠腹水离心计数后,将2 0×109的肝癌细胞悬液0.2mL注射到70只Balb/c小鼠腹股沟皮下,于接种第二天,随机分为7组,瘤旁分别注射白藜芦醇500mg·kg-1,1000mg·kg-1,1500mg·kg-1,5-FUmg·kg-1,白藜芦醇+5-FU(1000mg·kg-1+1000mg·kg-1),白藜芦醇+5-FU(1500mg·kg-1+1000mg·kg-1)及等量的生理盐水,连续10d,观察毒性反应,停药后2d,称质量,同时处死小鼠,采血计白细胞数,切除肿瘤、胸腺及脾脏,称取质量,计算抑瘤率;同时检测巨噬细胞吞噬功能.显微镜及透射电镜下观察肝癌细胞病理变化及凋亡情况.结果:白藜芦醇500mg·kg-1,1000mg·kg-1,1500mug·kg-1,5-FU1000mg·kg-1,白藜芦醇+5-FU(1000mg·kg-1+1000rmg·kg-1),白藜芦醇+5-FU(1500mg·kg-1+1000mg·kg-1)可抑制Balb/c小鼠肝癌移植瘤的生长,其抑瘤率分别为31 5%,45.6%,48.7%,78.1%,90.0%和97.2%,与对照组比较差异显著(P<0.05),与5-FU合用可显著增加其抑瘤率(P<0.05).不同剂量白藜芦醇与5-FU配伍合用,白细胞数提高30.8%(P<0.01);胸腺重量提高35.4%(P<0.01);脾脏重量提高28 1%(P<0.01),与对照组比较差异显著(P<0.01);吞噬率及吞噬指数分别提高84.1%和36.5%(P<0.05).透射电镜下白藜芦醇体内可诱导鼠肝癌细胞H22的凋亡,有典型的细胞凋亡形态学特征.结论:不同剂量的白藜芦醇与5-FU配伍,能显著增强5-FU对小鼠移植瘤H22的抑瘤率,且对5-FU具有一定的增效减毒作用.
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胰高糖素样肽GLP-1(7-36)NH2对β细胞内游离钙和胰岛素分泌的影响
GLP-1(7-36)NH2是“肠-胰岛轴”中重要的调节胰岛素释放的激素，我们采用新生大鼠胰岛细胞单层培养的方法，探讨了GLP-1(7-36)NH2对胰岛素分泌的作用，并以Fluo-3为探针，用粘附式细胞仪，研究了它对胰岛β细胞内游离Ca2+的作用。 一、材料与方法 1.胰岛细胞培养：出生2～3d的Wistar大鼠，无菌取出胰腺，Hanks液漂洗，剪碎，加入0.2%胰蛋白酶和2g/L V型胶原酶(Sigma公司产品)，置38℃水浴中反复振荡消化5～8min，用冰冷的Hanks液终止消化，及时分离消化物，离心收集细胞，加入含15%小牛血清的RPMI-1640培养基［1］。调整细胞浓度，接种于75mm3细胞培养瓶，置37℃、5% CO2和95%空气的培养箱中培养16h后，转入24孔培养板中，同时取一定量的细胞悬液接种于改良的Petri皿中(细胞浓度均为1×109个/L，记为0 d)，培养48h后，用新配制的碘乙酸2.5mg/L处理3～5h，再换无碘乙酸培养液继续培养，每两天换培养液一次，培养7d后，选生长良好的细胞用于实验［1］。
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msCs移植对扩张型心肌病TGF-β1、AT1、CYP11B2及心肌胶原表达影响的研究
目的：探讨经外周静脉途径移植骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells， msCs）治疗扩张型心肌病心衰的可行性及对TGF-β1、AT1、CYP11B2及心肌胶原表达的影响。
方法：1.扩张型心肌病心衰动物模型的构建与鉴定SPF级近雄性SD大鼠采用腹腔注射ADR的方法构建DCM心衰模型。给药第10周对两组大鼠行心脏超声检查，心肌组织HE、Masson病理染色、心肌胶原分析及免疫组化检测心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达，鉴定模型。2.骨髓间充质干细胞移植治疗扩张型心肌病将DCM大鼠经尾静脉注射含msCs的细胞悬液。于细胞移植第20周进行心脏超声检查，观察LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS。于末次移植后第20周末行心肌组织HE、Masson病理染色、心肌胶原分析及免疫组化检测心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达，RT-PCR扩增Ⅰ、Ⅲ胶原、TGF-β1、AT1、CYP11B2基因片段，检测其mRNA的表达。数据进行统计学分析。 -
白细胞介素10对小鼠哮喘模型气道炎症作用的研究
白细胞介素(IL)10是一种具有广泛免疫抑制活性的细胞因子,主要由Th2细胞分泌.目前IL-10能否用于支气管哮喘治疗存在较多争议,我们的研究旨在探讨IL-10对呼吸道合胞病毒(RSV)诱导的小鼠哮喘模型气道炎症是否有抑制作用.材料与方法雌性清洁级Balb/c小鼠30只,体重14～17 g(第一军医大学实验动物中心),分为三组,每组10只小鼠.对照组(A组):致敏和激发均用无病毒的Hep-2细胞株培养上清液.气道炎症组(B组):用灭活的RSV病毒为抗原,致敏后激发;IL-10治疗组(C组):同B组予RSV致敏后激发,RSV激发前1 h气道内滴入重组小鼠IL-10 (rmIL-10).Balb/c小鼠饲养在无RSV抗原条件下,采用2次致敏,1次激发建立小鼠气道炎症模型. 第1天皮下注射0.1 ml含6.25×105 PFU紫外线灭活的RSV(广州呼吸疾病研究所病毒室)及20 μg 氢氧化铝的生理盐水混悬液,第8天重复注射,第21天B组经乙醚麻醉后用0.1 ml 含6.25×105 PFU RSV的生理盐水,小鼠鼻腔内缓慢滴入激发小鼠气道炎症;A组:滴入0.1 ml等量未加病毒培养的Hep-2细胞悬液;C组:RSV激发前1 h鼻腔内滴入0.1 ml含200 ng rmIL-10(美国R&D公司)的生理盐水.
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钾通道开放剂对哮喘豚鼠支气管平滑肌电压依赖性钾通道的作用
采用膜片钳技术探讨哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞（BSMCs）电压依赖性钾离子通道（Ik）特性的变化和钾通道开放剂对哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞膜Ik的作用。 材料与方法健康豚鼠25只，雌雄不限，体重约300～400 g，分为（1）哮喘组5只（25例细胞）；正常对照组7只（28例细胞），行外向峰值钾电流测定；（2）哮喘组6只（24例细胞）；正常对照组7只（25例细胞），应用钾通道开放剂（Cromakalim）前后钾通道动力学特性变化测定。 支气管平滑肌细胞分离：将两肺组织中3～4级支气管剪成碎块，加入0.25% 胰蛋白酶，洗涤后再加入0.1% 胶原酶消化，用尖端抛光的Pasteur吸管吹打，用200目不锈钢网滤过，用DMEM培养液反复冲洗，即可得到富含支气管平滑肌细胞的细胞悬液。将细胞悬液分装到涂有多聚赖氨酸的小平皿内，静置20 min，选择细胞膜完整、有立体感，胞体呈梭形的细胞用作通道记录。 离子通道记录：采用膜片钳技术的细胞贴附式和全细胞记录式。细胞外液（mmol/L）:NaCl 135、KCl 5、MgCl2 l、CaCl2 l、HEPES缓冲盐水10。记录用微电极电阻约为3 MΩ，单通道电流经膜片钳放大器放大，探头反馈电阻为10 MΩ。低通滤波器滤波频率为3 KHz。全细胞式记录采用负压抽吸式打通膜片。
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阿托伐他汀对血管平滑肌细胞PKB信号转导途径的影响
1材料与方法主要材料:阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司),羟甲戊酸(Mevalonate,MVA,Sigma公司),鼠抗兔PKB/AKT多克隆抗体(Sant Cruz公司),蛋白A-琼脂糖(Amersham公司),γ 32PATP(北京亚辉公司),组蛋白H2B(Histon H2B,BM公司).细胞培养与计数:采用贴块法培养兔主动脉平滑肌细胞.取生长状态良好的第5～6代血管平滑肌细胞(VSMC)制成细胞悬液(4×104/m1),接种于24孔细胞培养板中,每孔L0.5ml,孵育24h,换无血清培养液继续培养24h后,加10%胎牛血清,同时分组加入阿托伐他汀(1umol/L)、阿托伐他汀(1umol/L)+MVA(250 umol/L),培养3 d后计数.
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基因修饰的永生化成纤维细胞移植治疗帕金森病研究
在体外实验的基础上,探索酪氨酸羟化酶(TH)和GTP环水解酶-1(GCH)修饰的永生化成纤维细胞混合移植对帕金森病(PD)的治疗作用.一、材料与方法1.永生化成纤维细胞制备及成纤维细胞TH基因和GCH基因修饰[1].2.大鼠偏侧PD模型制备及细胞移植:雄性SD大鼠50只,6-羟基多巴胺注射至右侧内侧前脑束制备偏侧大鼠PD模型.25只成功模型随机分为两组,治疗组14只,对照组11只.TH基因及绿色荧光蛋白(EGFP)基因修饰的成纤维细胞悬液按4∶1(v/v)的比例分别与GCH基因修饰的成纤维细胞悬液混合,分别用于治疗组和对照组.移植细胞分4点通过立体定向注射至右侧纹状体.每只大鼠移植细胞总数为2×105(体积10 μl),每点移植细胞数为4×104(体积2.5 μl).
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胃液对BIU-87细胞系细胞凋亡的影响
为探讨胃代膀胱术抑制膀胱肿瘤复发的机制，我们采用体外实验方法，观察胃液对膀胱癌细胞系BIU-87细胞凋亡的影响，报告如下。 材料与方法细胞培养及处理：将BIU-87细胞系置于37 ℃、5% CO2、含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，待细胞生长旺盛、进入指数增殖期时，收获培养瓶中的细胞，调配成2.5×105个/ml细胞悬液，接种至预先置有玻片的24孔培养板和T-75培养瓶，实验各组分别加入胃液(终浓度7.6 μmol/ml)、稀盐酸(终浓度7.6 μmo l/ml)、阿霉素(终浓度2 μg/ml)和无药培养液，继续置于37 ℃、5%CO2条件下培养，24 h后收集细胞进行检测。
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应用间期荧光原位杂交技术探讨cyclin D1 基因在乳腺癌中的扩增
本研究将用间期荧光原位杂交(interphase fluorescence in situ hybridization，FISH)技术研究cyclin D1基因在乳腺癌中的变化，为乳腺癌的术后治疗与预后评估提供新的生物学信息。 1．材料与方法：（1）试验材料:选取40例经手术切除治疗而病理诊断为乳腺癌的肿瘤组织，按国际TNM分期法(UICC 1988年)临床上属Ⅰ、Ⅱ期患者20例,Ⅲ、Ⅳ期患者20例。（2）细胞悬液的制备:制备单个细胞悬液，在杂交前2～4 d，将单细胞悬液滴在经处理过的玻片上，自然风干备用。(3)探针的制备：Cyclin D1探针购自Vysis公司(Fluoro-phore直接标记，呈红色)。(4)间期荧光原位杂交检测方法:玻片用100 μl RNA酶(100 μg/ml)37 ℃消化1 h，于70%甲酰胺2×SSC中(73±1)℃变性5 min后脱水，风干；同时将探针混合液(Lysis 杂交Buffer 7 μl，探针1 μl，2 μl纯净水)置(73±1)℃水浴箱内变性5 min，然后将变性探针混合液加于变性的细胞玻片上，封闭，置37 ℃温箱杂交过夜。将盖玻片取下，放入45 ℃ 50% 2×SSC甲酰胺内10 min共3次，然后再放入2×SSC液中洗10 min，后在室温放入加入0.1% NP-40的2×SSC内洗5 min和1 min（室温）凉干，加4′,6-二联脒-2-吲哚苯(DAPI)补染，在荧光显微镜下观看结果。（5）观察结果分析标准：在荧光显微镜下，选取肿瘤细胞分析，观察细胞核内荧光杂交信号并计数。每例计数100～200个细胞核。信号4～10为轻度扩增，10以上为
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细胞角蛋白20对膀胱癌早期诊断的前瞻性研究
新近研究发现，细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）是一种极有可能成为诊断膀胱癌及其随访的特异性生物标记物［1，2］。为此，我们对CK20在膀胱癌的早期诊断中的应用进行了初步探讨。 1．资料与方法：62例肉眼血尿患者，其中膀胱肿瘤术后随访发现血尿42例作前瞻性分析。所有患者进行膀胱镜检查及尿脱落细胞学和CK20检测。分析参数包括肿瘤数目、大小及WHO分级，术前或活检前留取尿液行脱落细胞学和CK20标志物免疫荧光检测。 收集晨起第1次新鲜尿100 ml。尿脱落细胞学检查按常规方式进行。将收集的尿液用Hanks液洗涤2次，1?500 r/min，5 min，收集沉淀细胞，以完全RPMI 1640培养基将沉淀细胞制成细胞悬液(2×105/ml)，37 ℃温箱中贴壁孵育6 h。原位冷丙酮固定10～15 min，用PBS洗涤3×3 min后，滴加抗CK20单抗，置湿盒内4 ℃过夜；PBS洗涤3×3 min后滴加荧光标记抗体羊抗鼠IgG-FITC 1∶10，37 ℃,40 min；PBS洗涤3×3 min后，荧光显微镜下观察并摄片。细胞浆和细胞膜发黄绿色的荧光为阳性反应。
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自体黑素细胞培养移植治疗肢端型白癜风及相关因素分析
白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病,病因复杂,治疗困难,肢端型白癜风治疗更困难[1-2].自体黑素细胞培养移植是治疗白癜风的一种有效方法,近年来国内外陆续有不少使用该方法成功治疗白癜风的报道[3-7].我们在先前的黑素细胞培养的基础上[s],对培养基和方法进行了改进和规范,检测和计算了黑素细胞的分裂时间(DOT)、黑素含量(M)和黑素制造量(MP),同时用在体外培养的自体纯黑素细胞悬液进行移植治疗了38例67处皮损肢端型白癜风,效果良好.
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构建卵巢上皮性癌原位移植瘤动物模型的新方法
构建卵巢上皮性癌(卵巢癌)的动物模型方法包括:裸鼠皮下移植瘤模型[1],腹腔移植瘤模型[2],裸鼠网膜移植瘤模型[3],原位移植-转移瘤模型[4]等.原位移植因为可以提供给被移植物类似于人体的微环境所以有广阔的应用前景.目前的原位移植技术主要是用细胞株构建裸鼠皮下移植瘤作为供瘤体,切成小块后在解剖显微镜下打开卵巢的包膜,将组织块植入卵巢实质[5].该技术只能间接反应卵巢癌细胞株的特点;此外难度高,需要解剖显微镜等特殊仪器.本研究在实验过程中巧妙地使用了一种新方法,将细胞悬液直接注射到小鼠的卵巢实质内,成功地建立了糖尿病合并重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠卵巢癌模型,现报道如下.
