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Leber视神经萎缩的基因诊断
Leber视神经萎缩是一种典型的线粒体DNA突变所致的母系遗传病,好发于青壮年[1].早期临床表现常与视神经炎相似,有些患者有家族史,有些则为偶发,对无家族史的首诊患者临床容易误诊.本文应用等位基因特异性聚合酶链反应(ASPCR)对50例疑诊患者的线粒体DNA11778位进行分析,现报告如下.
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血浆卵泡抑素结构域跨膜蛋白基因甲基化异常在大肠癌诊断中的价值
2003年Sabbioni等[1] 报道,在71%的大肠癌患者血浆中有含表皮生长因子和卵泡抑素结构域跨膜蛋白(TPEF)基因甲基化的改变,TPEF基因异常甲基化有望成为大肠癌早期诊断的有价值的分子标志物.本研究用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术分析32份大肠癌组织标本,以建立检测血浆TPEF基因甲基化异常的方法,现报告如下.
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甲基化特异性聚合酶链反应关键步骤的质量评价与试验技巧
随着表观遗传学研究的发展,DNA甲基化备受关注.目前研究甲基化的方法众多,Herman等[1]报道的甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)具灵敏、快速、简便等优点,应用为广泛.但该方法针对特异位点判定结果时,易受诸多因素影响,因此试验条件要求极为严格;然而试验中缺少质量评价体系.对此,本室较系统地分析了MSP关键步骤的评价方法和条件,摸索出一些方法和捷径,现介绍如下.
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G蛋白偶联受体激酶4基因多态与原发性高血压关联研究
人类G蛋白偶联受体激酶4基因定位于染色体4p16.3参与机体对血压的调控.本研究采用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)结合实时荧光分析的方法,对中国江苏南通地区93例健康人,102例原发性高血压患者的G蛋白偶联受体激酶4基因变异(GRK4γ)多态位点A486V进行基因分型,探讨GRK4基因多态与原发性高血压的相关性.
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肺癌组织p16基因启动子区甲基化的研究
DNA甲基化可以引起染色体结构、DNA构型和稳定性及DNA与蛋白质分子相互作用方式的改变,从而控制基因表达[1].研究发现,基因缺失和启动子区异常甲基化是p16基因失活的主要原因[2].我们联合应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MSPCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化方法检测肺癌组织中p16基因的异常改变,以了解p16基因在肺癌发生发展中的作用.
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黑龙江地区慢性阻塞性肺疾病与肿瘤坏死因子基因多态性的相关性研究
肿瘤坏死因子(TNF)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的气道炎症和肺功能损害中起重要作用.已知肿瘤坏死因子α(TNF-α)和TNF-β存在单核苷酸多态性(SNP)TNF-α-308G/A和TNF-β+252G/A,影响TNF在气道内的表达,因而可能是COPD发病的分子机制之一.我们的研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)方法,分析黑龙江地区汉族COPD患者及健康人群的TNF基因多态性分布情况,探讨其多态性在COPD发病中的作用.
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半巢式MSP在急性白血病患者p15基因甲基化检测中的应用
传统的观点认为,基因的缺失和突变是基因失活的主要方式,近研究显示,基因异常甲基化所导致的基因沉默亦是基因失活的方式之一.在多种恶性血液病中,p15基因发生异常的主要途径是基因异常甲基化和缺失.目前国内文献上p15基因甲基化的检测方法主要集中在甲基化敏感限制性酶切和Herman等[1]总结的甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法.我们通过优化MSP方法,设计了p15基因的半巢式-MSP(Hn-MSP)引物对85例急性白血病(AL)患者进行了p15甲基化状态的检测.
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卵巢上皮性癌组织和细胞中BRCA1基因的DNA甲基化程度与其mRNA和蛋白表达的关系
文献报道,90%的家族性卵巢上皮性癌(家庭性卵巢癌,指有家族史的卵巢癌患者)与BRCA1基因突变有关[1],而BRCA1基因突变仅发生在极少的散发性卵巢癌(指患者的一级和二级亲属中未发现卵巢癌患者)中[2],但无论是在家族性还是散发性卵巢癌中,约90%的患者其癌组织中的BRCA1 mRNA和蛋白表达水平下降[1].除基因突变外,引起肿瘤抑制基因失活的另一个机制就是DNA甲基化[3].在散发性卵巢癌组织中BRCA1基因的DNA甲基化已有报道[4],然而对于散发性卵巢癌组织中BRCA1基因的DNA甲基化程度与BRCA1基因表达下降的关系仍不是很清楚.本研究对42例散发性卵巢癌组织和7株卵巢癌细胞,应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术、RT-PCR技术和免疫组化法检测BRCA1基因的DNA甲基化程度和其mRNA及蛋白的表达,探讨不同病理类型的卵巢癌组织中BRCA1基因的DNA甲基化程度,及其与BRCA1 mRNA和蛋白表达的关系.
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淋巴瘤Raji细胞Id4基因甲基化的检测及意义
目的 检测恶性淋巴瘤细胞Id4基因是否发生了甲基化.方法 体外培养人Burkitt's淋巴瘤细胞株Raji细胞,用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)法检测Raji细胞的Id4基因甲基化状态,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Id4 mRNA的表达情况.结果 MS-PCR法检测显示Raji细胞的Id4基因存在高甲基化状态,RT-PCR法未检测出Id4 mRNA表达.结论 人Burkia's淋巴瘤细胞株Raji细胞Id4基因呈现高甲基化状态,Id4基因表达沉默.
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血小板糖蛋白Ⅰbα Kozak基因多态性与脑梗死的相关性
近一些研究证实了血小板糖蛋白(GP)Ⅰbα基因多态性和动脉血栓性疾病关系密切,GP Ⅰbα基因多态性可能是动脉血栓性疾病的一个遗传危险因素[1,2].我们应用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)扩增和基因序列测定技术,研究在青岛地区汉族人群中GP Ⅰbα Kozak等位基因T/C多态性与脑梗死是否有相关性,报道如下.
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白血病细胞系中抑癌基因PTEN启动子区甲基化状态检测及其去甲基化研究
目的 探讨抑癌基因PTEN表达沉默的机制及诱导PTEN表达对白血病细胞的作用.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation specific PCR,MSP)检测白血病细胞系HL-60、Nalm-6、Raji、KG-1a、U937、NB4、K562中PTEN基因启动子区域甲基化状态;用甲基化转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理白血病细胞,MSP检测甲基化状态的改变、RT-PCR检测PTEN mRNA水平的改变、瑞特染色观察细胞形态学改变、膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)标记染色检测细胞凋亡.结果 检测的白血病细胞系中HL-60、Nalm-6、Raji、KG-1a、U937细胞PTEN基因显示超甲基化状态,而NB4和K562细胞显示低甲基化状态;5-Aza-CdR处理HL-60和Nalm-6细胞后,PTEN基因甲基化降低、mRNA表达水平则逐渐增高,并呈剂量依赖性,细胞出现凋亡现象.结论PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活或沉默,甲基化抑制剂可以诱导PTEN表达,并引起白血病细胞凋亡.
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急性白血病患者p15与p16基因甲基化检测及mRNA表达水平的定量分析
近年研究发现肿瘤细胞中存在DNA甲基化分布异常.即在肿瘤细胞中同时还存在基因组某些区域,特别是在一些抑癌基因的启动子区域高甲基化现象.抑癌基因启动子及转录起始区高甲基化可能也是导致抑癌基因失活和细胞恶性转化的机制之一[1].抑癌基因p15(CDK2B)和p16(CDK2A)均位于人类9号染色体短臂(9p21),编码两种细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制性蛋白,参与细胞增殖与分化的调节[2,3].为探讨p15与p16在白血病细胞的甲基化状态及与表达水平的关系,我们应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术检测40例初诊急性白血病(AL)患者p15和p16甲基化状态,同时用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-QPCR)技术检测p15和p16基因mRNA表达水平.
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急性白血病及骨髓增生异常综合征患者p15基因甲基化模式改变及其意义
p15基因是位于染色体9p21的一个抑癌基因,其编码产物p15蛋白可抑制细胞周期素依赖性激酶CDK4/6,使Rb蛋白磷酸化受阻,从而阻止细胞由G1期进入S期.p15基因的失活可导致细胞增殖失控,与某些肿瘤的发生有关[1].但近年研究发现,在某些恶性血液病, 如急性白血病(AL)中,p15基因失活的主要原因并非基因缺失或突变,而是启动子区的异常高甲基化[2-4];有显著白血病转化倾向的骨髓增生异常综合征(MDS)中亦发现p15基因甲基化异常[5,6].为探讨p15基因甲基化异常与AL发病及MDS向白血病转化的关系,我们采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation Specific Polymerase Chain Reaction, MSP)技术,对不同病期AL及MDS患者的p15基因转录起始区CpG岛甲基化状态进行了研究.
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白血病等恶性血液病中p15基因甲基化的检测及临床意义
p15基因位于染色体9p21,是一种肿瘤抑制基因,其编码产物p15蛋白特异地抑制细胞周期素依赖激酶4/6(CDK4/6), 使细胞不能通过G1期和S期间的监测点,从而停留在G1期.血液系统恶性肿瘤有高频率的p15基因失活[1],研究发现5′启动子及转录启始区域内的CpG岛的异常甲基化是p15基因的主要失活方式[2].Herman等[3]研究出甲基化特异性聚合酶链反应(MSP),为基因CpG岛甲基化研究提供了有效的方法.
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一种简单的筛选耐甲氧西林葡萄球菌方法
目的推荐美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)关于6 μg/ml苯唑西林+4%NaCl盐平板(以下简称盐平板法)检测甲氧西林耐药葡萄球菌.方法使用NCCLS推荐的盐平板法检测华山医院临床分离的葡萄球菌共894株.结果 (1) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)苯唑西林纸片法的检出率为84.2%(538/639),盐平板法的检出率为86.4%(552/639),而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)的检出率2种方法分别为82.0(209/255)、90.6%(231/255);(2) 有14株纸片法测定为中介的金黄色葡萄球菌和22株纸片法检测为甲氧西林敏感(MS)的凝固酶阴性葡萄球菌,盐平板检测均为甲氧西林耐药(MR),经聚合酶链反应(PCR)检测mecA基因结果均为阳性,显示PCR检测与盐平板检测结果一致;(3) 随机取上述纸片法和盐平板2种方法检测均为MS者9株、MR者15株,同时进行mecA基因的PCR检测,结果显示全部与盐平板法和苯唑西林纸片法检测结果符合.结论在临床微生物实验室应该采用NCCLS推荐的6 μg/ml苯唑西林+4%NaCl盐平板对MRSA和MRCNS进行检测,以供临床诊断和选用抗生素.
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胃癌中抑癌基因PTEN甲基化状态的检测
胃癌发生涉及多种抑癌基因、癌基因的异常表达.PTEN作为一种广泛的抑癌基因,在多种肿瘤中存在失活现象.其失活原因除突变、缺失外,DNA异常甲基化可能是其失活的第三条途径.本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测胃癌细胞和组织中PTEN基因甲基化状态,探讨其甲基化改变特点与临床病理特征的关系,为胃癌的发生机制提供分子生物学依据.
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脱氧核糖核酸甲基化与胃癌RASSF1A基因失活的相关性研究
胃癌的发生发展是遗传因素、环境因素、癌基因激活、抑癌基因缺失等多步骤参与的渐进过程。RASSF1A基因是近确定的一种候选抑癌基因，它在多种人类恶性肿瘤中因启动子区甲基化而致表达缺失。DNA甲基化是指在具有胞嘧啶甲基转移活性的DNA甲基转移酶(DNMT)催化下，将甲基基团转移至某些基因的碱基上并进行转录水平调控。DNMT1是维持机体现有DNA甲基化模式的关键因素。本研究运用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR，MSP)检测沉默DNMT1基因后SGC-7901细胞RASSF1A基因表达情况及DNA甲基化状态改变情况，探讨DNMT1基因与胃癌RASSF1A基因失活的关系。
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直肠癌切缘黏膜组织p53基因370位点甲基化的表达
目的 检测直肠癌下切缘中黏膜p53基因K370位点甲基化表达,探讨“分子界定”的临床意义,评估p53基因370位点甲基化与安全切缘的关系.方法 选取2000年1月至2007年7月在武汉大学人民医院外科确诊并接受直肠癌前切除术治疗的直肠癌患者197例,术后1～3年吻合口复发的46例,未复发151例,同时取20例正常直肠黏膜标本作为阴性对照.根据复发的情况,分为复发组、未复发组以及对照组.用免疫组织化学法检测p53蛋白表达应用免疫组织化学技术检测切缘组织中p53蛋白的表达.用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术,检测切缘组织中p53基因K370位点甲基化,并通过Pearson统计学方法分析两者的相关性.同时统计各组患者年龄、性别、肿瘤大小、临床分期等差异是否有统计学意义.结果 复发组、未复发组及对照组织切缘标本p53蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).所有46例复发组中有41例发生甲基化,甲基化率为89.1％,未复发组(12/115例)和对照组出现低甲基化和未发现甲基化,两组间差异有统计学意义(P＜0.01).复发组K370位点甲基化率高于未复发组.K370的甲基化率在肿瘤直径和距肛缘距离以及TNM分期方面差异有统计学意义(P＜0.01),但是,在患者年龄、性别方面差异无统计学意义(P＞0.05).结论 p53基因的K370位点甲基化可以作为安全切缘指标和预测局部复发、远处转移和生存率的预后指标的标准,准确评估K370位点甲基化有利于合理选择安全切缘.
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WIF-1基因启动子甲基化与肝细胞癌的相关性研究
目的:探讨肝细胞癌(HCC)的发生与WIF-1基因启动子甲基化的相关性.方法:通过甲基化特异性PCR (MSP)检测WIF-1基因启动子在76例(实验组)HCC组织中的甲基化率,并随机留取伴肝硬化患者癌旁肝硬化组织标本47例(对照组),分析WIF-1基因启动子甲基化与HCC的相关性.结果:与肝硬化癌旁组织比较,HCC组织WIF-1基因启动子甲基化阳性率明显增高(P＜0.05),并且HCC组织中WIF-1甲基化阳性率与甲胎蛋白(AFP)之间存在负相关关系(r=-0.759,P＜0.001).结论:WIF-1基因启动子甲基化与HCC的发生有关;在HCC中WIF-1基因启动子甲基化与AFP浓度呈明显负相关关系.
