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酸性鞘磷脂酶来源的神经酰胺调控T细胞跨脑内皮迁移过程中ICAM-1的功能
多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统的慢性的脱髓鞘紊乱，其所具有的特点是通过免疫细胞的浸润作用穿过脑血管入脑，至今为止这一个过程还没有完全被人们所理解。同时，作者在之前的研究发现鞘脂代谢被改变，在多发性硬化症（MS）病变中起着重要的作用。另外作者提出了一种酸性鞘磷脂酶（ASM），这种酶是在脂质神经酰胺生产生物活性时起着关键作用的一种酶，并且其参与了多发性硬化症（MS）病变过程。然而，其在脑血管中的作用尚不清楚。T 淋巴细胞的转移是很大程度是依赖于如细胞间粘附分子-1（ICAM-1）这样的存在于血管上的粘附分子的作用。文章中作者假设酸性鞘磷脂酶（ASM）通过调节 ICAM-1的功能来达到控制 T 细胞迁移。为了研究内皮上的 ASM对迁移的影响，作者使用的慢病毒 shRNA 使脑内皮细胞中的 ASM失去活性。有趣的是，虽然在缺乏 ASM活性的细胞中 ICAM-1表达含量发生增加，但是测得 T 淋巴细胞粘附作用显著下降，并且得出结论这种迁移作用无论在静态还是流动条件都会发生的。这一潜在机制中，作者提出当内皮的 ASM缺乏活性时，在 ICAM-1的聚集丛上发生的埃兹蛋白的磷酸化以及细丝蛋白和 ICAM-1之间的相互作用都受到了干扰。在功能上，这一过程减少的微绒毛的形成和 T 细胞的受损内皮迁移。后，作者阐明 ASM通过调节其与细丝蛋白和磷酸埃兹蛋白的相互作用从而达到调节脑内皮细中 ICAM-1的功能。对于 T 淋巴细胞转移这一潜在的作用机制的进一步了解对于形成一个有效的治疗多发性硬化症（MS）的发生是非常有重要意义的。
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HEK293细胞中细丝蛋白-C对α1A-肾上腺素受体介导细胞外信号调节激酶磷酸化作用的影响
目的寻找与α1A-肾上腺素受体(α1A-AR)相互作用的胞浆内非G蛋白,研究蛋白对受体信号转导的影响.方法应用酵母双杂交技术,以人α1A-AR胞浆内C末端(α1A-AR-CT)为诱饵,筛选人脑cDNA文库,用5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-Gal)定性分析及邻硝基苯基β-D-半乳糖苷(ONPG)定量分析对筛选出的阳性克隆细丝蛋白-C(FLN C)进行确证.采用脂质体转染及蛋白免疫印迹技术探讨人胚胎肾293(HEK293)细胞中FLN C对α1A-AR信号转导通路的影响.结果①缺陷培养基筛选出FLN C的C末端部分片段可以与α1A-AR-CT在酵母中结合.②X-Gal定性分析中,FLN C与α1A-AR-CT的共转子菌落6 h即呈现蓝色,而对照菌落颜色无变化;经ONPG定量分析发现,FLN C与α1A-AR-CT的共转子中β-半乳糖苷酶的活性大约是对照的2～3倍(P<0.01).③编码FLN C的C末端片段的质粒瞬时转染于稳定表达全长α1A-AR的HEK293细胞中,可以明显增强去氧肾上腺素(10 μmol*L-1,30 min)激动α1A-AR介导的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)磷酸化作用.结论 FLN C的C末端部分片段可以与α1A-AR-CT在酵母中结合,并且增强HEK293细胞中α1A-AR介导ERK1/2磷酸化的作用.
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大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经元中细丝蛋白表达的实验研究
目的观察大脑中动脉缺血再灌注(MCAO/R)大鼠模型神经元中细丝蛋白(filamin,FLN)表达的变化情况,结合其超微结构改变,了解脑血管病变后神经元结构功能变化与FLN表达的相关性.方法制备MCAO/R大鼠模型,依照再灌注时间的不同分为2h、6h、12h、24h、3d及7d共6组,正常大鼠做对照组.按时相点取材,草酸-焦锑酸钾电镜观察,应用免疫组织化学方法染色并进行图像分析.结果除正常对照组外,其他各组神经元中均有阳性反应,12h、24h、3d组神经元中FLN表达较多,以3d时明显.阳性神经元细胞集中在缺血半球皮质区.神经元中FLN阳性部位为胞浆的核周边部,表达均匀一致.胶质细胞中未见表达.结论再灌注损伤可引起神经元中细丝蛋白免疫阳性的表达,并与损伤时间的变化及神经元形态学改变有一定相关性,提示此现象可能与神经元的再生、修复及移行有关,有进一步研究的价值.
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大鼠血睾屏障形成初期细丝蛋白A对肌动蛋白丝排布的影响
目的 根据肌动蛋白丝(F-actin)在血睾屏障(BTB)形成与变化过程中发挥的作用,初步探讨细丝蛋白A(FLNA)在大鼠血睾屏障形成初期对F-actin排布的影响.方法 Western印迹检测FLNA在大鼠睾丸、支持细胞及精子中的表达;免疫荧光染色观察FLNA与F-actin在20 d龄大鼠生精上皮中的共定位;体外无血清体系分离培养大鼠睾丸支持细胞,待细胞连接形成后通过siRNA干扰沉默FLNA的表达,鬼笔环肽染色观察F-actin的分布定位;睾丸内siRNA注射,观察FLNA对血睾屏障形成时F-actin分布的影响.结果 FLNA在20 d龄大鼠主要由支持细胞表达,体外siRNA沉默FLNA的效率可达70%以上,在体外支持细胞连接形成及体内屏障形成过程中,FLNA沉默组的F-actin与对照组相比排列紊乱、无序.结论 FLNA参与调节大鼠血睾屏障形成初期FLNA的排布.
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大鼠血睾屏障形成初期细丝蛋白A对肌动蛋白丝排布的影响
目的 根据肌动蛋白丝(F-actin)在血睾屏障(BTB)形成与变化过程中发挥的作用,初步探讨细丝蛋白A(FLNA)在大鼠血睾屏障形成初期对F-actin排布的影响.方法 Western印迹检测FLNA在大鼠睾丸、支持细胞及精子中的表达;免疫荧光染色观察FLNA与F-actin在20 d龄大鼠生精上皮中的共定位;体外无血清体系分离培养大鼠睾丸支持细胞,待细胞连接形成后通过siRNA干扰沉默FLNA的表达,鬼笔环肽染色观察F-actin的分布定位;睾丸内siRNA注射,观察FLNA对血睾屏障形成时F-actin分布的影响.结果 FLNA在20 d龄大鼠主要由支持细胞表达,体外siRNA沉默FLNA的效率可达70%以上,在体外支持细胞连接形成及体内屏障形成过程中,FLNA沉默组的F-actin与对照组相比排列紊乱、无序.结论 FLNA参与调节大鼠血睾屏障形成初期FLNA的排布.
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Nelin与F-actin及Filamin相互作用的鉴定
目的 在用酵母双杂交方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选,得到3个阳性克隆的基础上,进一步探讨新基因Nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的功能,并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质.方法 采用基因转染和表达技术,在真核细胞内外分别进行了Nelin蛋白与肌动蛋白(F-actin)结合的共沉降及免疫荧光共定位实验.并通过免疫共沉淀实验进一步验证所得的实验结果.结果 证实了在细胞内外Nelin蛋白均能同F-actin相结合;还能与Filamin的C-末端免疫球蛋白样结构发生相互作用.结论 Nelin为一个新的兼有actin及Filamin结合能力的蛋白.在心肌细胞内,Nelin很可能作为一个膜一细胞骨架连接蛋白,参与了细胞黏着斑形成的过程.
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缺血再灌注损伤对新生鼠肾小管上皮细胞细丝蛋白的影响
目的通过研究缺血再灌注不同时段细丝蛋白在肾小管上皮细胞中的分布变化,探讨细丝蛋白在肾脏缺血再灌注损伤中所起的作用.方法建立新生大鼠不同时段的肾脏缺血再灌注模型,通过免疫荧光法检测细丝蛋白在肾小管上皮细胞上的分布及其表达量.结果细丝蛋白在正常时主要分布在肾小管上皮细胞基底部附近,缺血0.5 h时其分布变化不明显,再灌注0.5 h后,细丝蛋白开始向胞浆转移,并出现在细胞顶部和肾小管腔内,再灌注2 h这种改变明显并伴肾小管结构的破坏;从再灌注24 h起开始进入恢复阶段,细丝蛋白逐渐重新回到基底部,再灌注120 h后恢复阶段基本结束,肾小管结构正常.结论细丝蛋白在缺血再灌注时分布发生改变,这种变化出现在肌动蛋白细胞骨架和整合素的改变之前.
