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腺垂体细胞培养及低温冻存研究
垂体移植目前依就是解决垂体功能低下的有效治疗手段.垂体细胞的培养及低温冻存是垂体移植研究中的基础.本文对腺垂体培养的发展过程及目前的现状进行了简要的回顾和概括,对低温冻存的理论发展过程做过综述,同时从腺垂体移植发展的角度对垂体细胞培养及垂体移植工作的意义前景做了展望.
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脐血造血干细胞短期冻存效果的评价
为了探讨脐血造血干细胞在液氮中短期冻存复苏后的效果,分别将各自为8例冻存6个月、1年、2年的脐血干细胞进行复苏,观察造血干细胞活性.有核细胞(NC)计数采用自动血细胞分析仪测定,CD34+细胞采用流式细胞技术测定,用体外造血细胞培养技术分析粒-巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)产率,台盼蓝染色法判断造血细胞存活率.结果表明:脐血造血干细胞在液氮中冻存6个月、1年、2年后解冻,其有核细胞、CD34+细胞、细胞活率、CFU-GM产率在3个不同冻存时间的差异无显著性.结论:脐血干细胞于液氮中短期冻存,其干细胞数量和细胞活性没有明显的变化,冻存效果较好.
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二甲基亚砜联合羟乙基淀粉的非程控降温法冻存脐血造血干细胞研究
为了探索有效低温保存脐血造血干/祖细胞的冷冻保护剂和技术,进行了二种方法试验.第一种方法联合使用二甲基亚砜(DMSO)和羟乙基淀粉(HES)(分子量120 000)作为冷冻保护剂并用非程控降温冷冻技术;第二种方法只使用DMSO作为冷冻保护剂并用程控降温仪冷冻技术保存脐血.对二种方法的效果进行比较.结果表明:15份脐血冻存后细胞存活率、CFU-GM回收率,无论在使用非程控降温的第一种方法和使用程控降温仪的第二种方法均无显著性差异.183份脐血质量检测结果及21例临床移植结果也显示两种方法无显著性差异.结论:联合使用DMSO和HES作为冷冻保护剂并用非程控降温冷冻的方法对脐血造血干细胞有良好的保护作用,是一种简单易行、省时省力、适合于脐血造血干细胞库大批量冻存脐血的方法.
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肝细胞体外培养技术的研究现状
本文综述了肝细胞原代分离、低温冻存、培养液补充物、常用肝细胞培养方法等肝细胞体外培养的有关内容,强调非实质细胞和基质生物学在维持细胞形态和功能方面的重要性.体外肝细胞培养技术及其应用方式都取得了长足进步,反映了肝组织生物学的重大进展.许多新技术已应用于临床,取得良效,如微囊肝技术用于肝细胞移植肝细胞中空毛细血管三维培养技术用于生物型人工肝支持系统等.随着肝细胞生物学和细胞培养技术以及细胞工程技术的发展,我们将能更好地模拟肝细胞的体内生长环境,从而体外大规模长期培养活力旺盛功能良好的肝细胞,应用于临床.
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外周血单个核细胞冻存后诱导为CIK细胞及其抗肿瘤效应的研究
目的 研究低温冻存对处周血单个核细胞(PBMNCs)诱导为CIK(cytokine-induced killer)细胞及抗肿瘤效应的影响.方法 采用非程控降温方法冻存外周血单个核细胞,复苏后诱导为CIK细胞,与新鲜的未经冻存的外周血单个核细胞诱导的CIK细胞进行扩增能力、细胞纯度、细胞毒活性等比较.结果 冻存后的外周血单个核细胞诱导生成的CIK细胞在扩增能力、细胞纯度、细胞毒活性等方面与新鲜细胞直接诱导生成的CIK细胞无显著性差异.结论 冻存后的外周血单个核细胞可以诱导生成具有抗肿瘤活性的CIK细胞,研究结果对CIK细胞的应用具有重要意义.
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二甲基亚砜与羟乙基淀粉程控降温与低温冰箱降温保存造血干细胞的比较
目的 为造血干细胞的低温保存选择合适的保护剂和简便的保存方法.方法 血细胞分离机分离的外周血细胞,加入二甲基亚砜或羟乙基淀粉,超低温冰箱降温(保存)或自控程序降温液氮保存,定期检测细胞的粒单系造血细胞、长期培养起始细胞、CD34+细胞、台盼蓝拒染细胞,计回收率.结果 超低温冰箱降温保存与自控程序降温在液氮内保存,复温后粒单系造血细胞、长期培养起始细胞、CD34+细胞、台盼蓝拒染细胞的回收率,就降温与保存条件而言,两者差异不明显,但就保护剂来说5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉优于10%二甲基亚砜.超低温冰箱降温液氮保存和超低温冰箱降温保存,与自控程序降温液氮保存比较,在1年内保存良好,无明显差异(P＞0.05);但2年后,超低温冰箱降温保存者细胞活力下降.细胞复温后,细胞内保护剂不稀释也不洗涤,在室温放置,则对细胞活力有影响,以10%二甲基亚砜为保护剂影响大;而5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉为保护剂者虽然对细胞也有影响,但比10%二甲基亚砜为保护剂者影响要小.结论 保存外周血干细胞时,我们推荐使用5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉为保护剂;保存期在1年内,可用超低温冰箱降温保存;超过1年时,超低温冰箱降温用液氮保存.细胞复温后,细胞内保护剂应立即稀释或去除.
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急、慢性髓性白血病细胞低温冻存后诱生的树突状细胞生物特性研究
目的 观察急、慢性髓性白血病原代细胞经低温冻存后诱生的白血病源性树突状细胞的生物特性.方法 取急、慢性髓性白血病原代细胞,一部分细胞立即培养,一部分细胞用5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉为保护剂,-80℃冰箱降温,液氮保存一定时间后复温培养.培养时细胞内加重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4、肿瘤坏死因子-α等细胞因子,培养12 d,为白血病源性树突状细胞,观察细胞形态及免疫表型、自身混合淋巴细胞反应及细胞毒T淋巴细胞杀伤自身白血病细胞活性.结果 急、慢性髓性白血病新鲜或冻存的原代细胞,经组合细胞因子培养,细胞均不同程度地出现典型的树突状形态,细胞表面CD80、CD54、人白细胞表面抗原DR、CD1a、CD83、CD86表达上调,CD14下调;冻存原代细胞经培养生成的白血病源性树突状细胞,还表现为自体混合淋巴细胞反应和T淋巴细胞杀伤自体白血病细胞活性明显.结论 急、慢性髓性白血病新鲜或经低温冻存的原代细胞可诱生为白血病源性树突状细胞,这种细胞可诱导T淋巴细胞杀伤自身白血病细胞,为用树突状细胞免疫治疗微小残留病提供了实验依据.
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低温冻存基质细胞特性的研究
目的探讨骨髓细胞低温冻存后贴壁基质细胞培养生长的基本特性,为低温冻存基质细胞的应用提供实验依据.方法取新鲜骨髓和经Dexter长期培养法培养14 d的骨髓贴壁基质细胞(称"新鲜基质细胞"),用5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉为保护剂,-80℃冰箱降温,-196℃液氮冻存(前者称"冻存骨髓",后者称"冻存基质细胞")2周,复温后,再用Dexter法培养这些细胞,检测细胞增殖、细胞形态、细胞化学染色、细胞表面及基质细胞支持另一骨髓造血细胞形成的鹅卵石造血区、长期培养起始细胞等为指标,比较它们的生长特性、成分及功能.结果生长特性:冻存骨髓比新鲜骨髓出现贴壁细胞、细胞丛和细胞融合成片迟1～2 d,冻存基质细胞融合成片比新鲜基质细胞迟12～18 h;冻存骨髓与新鲜骨髓,冻存基质细胞与新鲜基质细胞增殖数比明显低.细胞成分:冻存骨髓比新鲜骨髓形成的成纤维细胞、内皮细胞比率下降,而巨噬细胞和脂肪细胞比率升高,冻存基质细胞上述现象更明显;内含凋亡小体的细胞冻存基质细胞多于新鲜基质细胞,冻存骨髓细胞多于新鲜骨髓;冻存骨髓和冻存基质细胞台盼蓝拒染率分别为95.2%、89.5%;冻存骨髓、冻存基质细胞CD14、人白细胞DR抗原表达百分率比新鲜骨髓、新鲜基质细胞高,CD45、CD33反之.细胞功能:新鲜骨髓、新鲜基质细胞、冻存骨髓和冻存基质细胞形成的鹅卵石造血区和长期培养起始细胞,生长良好,无显著差异.结论不管是骨髓细胞还是经培养生成的贴壁基质细胞,经5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉冷冻冻存、复温后培养,生物特性有一定损伤,但仍有较好的支持造血功能.
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外周血造血干细胞的采集、冻存与质量检测的研究
目的 探讨外周血造血干细胞(peripheral blood stem cells,PBSCs)的采集、低温冷冻保存、复苏与质检的方法.方法 2014年6月至2016年12月火箭军总医院成功采集191人次PBSCs,在无菌条件下加入主要成分为二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)的冷冻保存液,经程序降温仪降至-80℃后置于-196℃液氮保存.冻存前和解冻后分别进行单个核细胞(mononuclear cell,MNC)和CD34+细胞计数及粒单系祖细胞集落(colony forming unit granulocyte-macrophages,CFU-GM)培养.结果 共成功冻存266份的造血干细胞.采集的干细胞成品量、细胞浓度、MNC计数、CD34+计数、CFU-GM均值分别为(164.12±97.71) ml、(3.00±0.87)×1011个、(4.36±1.39)×108/kg、(5.76±1.32)×106/kg、(80.00±1 9.00)×106.对复苏的178份造血干细胞进行质量检测,MNC和CD34+细胞计数、CFU-GM回收率及台盼蓝拒染率分别为(95.64±2.72)％、(93.92±3.51)％、(91.25±3.13)％和(94.10±6.00)％.冻存前后的外周血干细胞均可满足临床移植的需求.结论 本研究采用的PBSCs采集、低温冷冻保存、复苏与质检的方法对干细胞损伤较小,安全有效,适合临床推广使用.
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脐血造血细胞分离及低温冻存保护剂研究通过鉴定
本报通讯员、深圳市卫生局(518020) 袁立新、曾丘林报道 广东省深圳市宝安区中心血站研究人员经2年努力,在脐血造血细胞分离及低温冻存技术的研究中取得重要成果.
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低温冻存对脐血树突状细胞生物特性的影响
目的:观察低温冻存对脐血来源的树突状细胞(DCs)培养生物特性的影响,为DCs的应用提供冻存方法.方法:设未冻存脐血细胞(UFCB)经增殖培养后产生的DCs(UFDCs) 为对照组,来源于经低温冻存的脐血(CPCB)的DCs和经低温冻存的DCs(CPDCs)为实验组,比较实验组与对照组DCs生物特性,包括细胞增殖量,不染色和染色的细胞形态,台盼蓝拒染回收率(TBR);细胞表面抗原;混合淋巴细胞培养剌激指数(SI)、抗毒-杀灭效应处理率(ER).结果:CPCB与UFCB比,形成DCs的时间迟,细胞增殖量、树突状细胞量、CD1a、CD83、HLA-DR表达、SI、ER均低.CPDCs与UFDCs比,形成贴壁树突状细胞迟,细胞增殖量、树突状细胞量、CD1a、CD83、HLA-DR表达、SI、ER均低.CPCB 的TBR为95.8%,CPDCs的TBR为88.7%.结论:脐血细胞和经增殖培养的脐血DCs,经低温冻存后复温培养,DCs的生物特性有一定的损伤,但基本功能仍比较完整,回收率均>85%.
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低温冻存对骨髓基质细胞生物学特性的影响
目的:探讨低温冻存对骨髓细胞和贴壁基质细胞生物学特性的影响.方法:取新鲜骨髓和经Dexter法培养14 d的骨髓贴壁基质细胞(称"基质细胞"),经-196℃液氮冻存(前者称"冻存骨髓",后者称"冻存基质细胞")2周,复温,再用Dexter法培养这些细胞,检测细胞增殖、细胞形态、细胞化学染色、细胞表面抗原及基质细胞支持另一骨髓造血细胞形成的鹅卵石造血区(CAFC),长期培养起始细胞(LTC-IC)的变化,比较冻存对骨髓细胞和基质细胞生物学特性的影响.结果:生长特性:冻存骨髓比新鲜骨髓、冻存基质细胞比新鲜基质细胞培养后融合成片的时间延迟,细胞增殖数比也有减低.细胞成分:冻存骨髓比新鲜骨髓形成的成纤维细胞、内皮细胞比率下降,而巨噬细胞和脂肪细胞比率升高,冻存基质细胞上述现象更明显;冻存后含凋亡小体的细胞在骨髓细胞和基质细胞内均有增加.细胞表面抗原:冻存骨髓、冻存基质细胞CD14、HLA-DR抗原表达百分率比新鲜骨髓、新鲜基质细胞高,CD45、CD33反之.支持造血:冻存前后骨髓和基质细胞支持形成的CAFC和LTC-IC,生长良好,无显著差异.结论:骨髓细胞和经培养生成的贴壁基质细胞,经冻存和复温,生物学特性有一定变化,但仍可以保留良好的支持造血重建功能.
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外周血造血干细胞不同保存方法的比较
目的:为造血干细胞低温保存选择合适的方法.方法:20例外周血单个核细胞加入DMSP或DMSO加HES,-80℃冰箱(简称冰箱)或程控降温,冰箱或液氮保存,定期检测标本的CFU-GM,LTC-CD34+,TBR,计回收率.结果:冰箱降温并保存,5%DMSO-6%HES为保护剂的CFU-GM、LTC-IC、CD34+、TBR回收率分别为:82.2%±14.7%、83.0%±12.2%、94.2%±4.3%、97.7%±3.9%,比10%DMSO者具体回收率明显高(P＜0.05);同一种保护剂下:冰箱降温并保存与程序降温冰箱保存比,差异不显著(P＞0.05),冰箱降温并保存、冰箱降温液氮保存及程控降温液氮保存,在一年内,各种回收率差异不显著(P＞0.05),二年时,只有冰箱降温并保存者其各种回收率指标明显下降(P＜0.05);细胞复温后,标本不稀释也不洗涤,室温下放置,细胞活力的各指标均下降(P＜0.05),以含10%DMSO为保护剂者影响大.结论:造血干细胞优选保存方法是:保护剂用5%DMSO-6%HES,保存时间不超过一年时,用冰箱降温并保存,长期保存时,冰箱降温则需液氮保存,细胞复温后,标本内保护剂应立即稀释(临床应用)或去除.
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深低温冻存十六年后脐血造血干细胞活性的检测
富含造血干祖细胞,已成功地用于儿童造血重建[1-2].脐血的采集特点决定了其必须深低温保存后再寻求应用,脐血在液氮中是否能够长期有效保持干细胞活力即成为应用的关键,但有关10年以上的脐血冻存.
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新型玻璃化冻存技术在活肿瘤组织样本库建设中的应用
背景:玻璃化冻存是一种新型的低温保存技术,在临床活肿瘤组织样本库的建设中具有潜在的应用价值.目的:探讨新型玻璃化冻存技术的有效性以及在活肿瘤穿刺组织样本库建设中的可行性.方法:将新鲜直肠癌肝转移活检组织样本随机分为2组,实验组作玻璃化冻存处理,对照组不作处理.取部分复苏后活检组织和部分新鲜活检组织分别接种于小鼠背部皮下,建立人源化移植瘤模型.对比观察活检肿瘤组织冻存前后生物学活性和组织学特征的变化.Calcein-AM活细胞染色和Hoechst33342染色反映细胞活性变化,Ki67标记免疫组织化学及苏木精-伊红染色反映组织的增殖能力和形态学特征变化.初步收集105例直肠癌肝转移活检组织并作玻璃化冻存,建立活性肿瘤穿刺组织生物样本库.结果与结论:直肠癌肝转移活检组织在玻璃化冻存前后未发生显著的生物学活性和形态学特征改变(P >0.05),说明新型玻璃化冻存技术可有效冻存活性穿刺肿瘤组织,并对生物样本库的建设具有实际应用价值.
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低温冻存时间对肿瘤组织生物大分子的影响
目的:探讨低温冻存时间对生物大分子DNA、RNA及蛋白质的影响,观察经长期低温冻存的肿瘤样本是否仍可满足科研的需求.方法:选择上海交通大学医学院附属瑞金医院上海消化外科研究所肿瘤样本库内2002至2006年间收集的手术切除胃癌标本20对(包括肿瘤组织及配对正常组织),用于提取组织总蛋白质和核酸,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度,采用凝胶电泳鉴定RNA、DNA完整性.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测核转录因子-κB(NF-κB)亚单位P65的mRNA表达;蛋白印迹(Western blot)法检测NF-κB蛋白表达.另随机抽取46例胃癌标本,检测其NF-κB P65的单核苷酸多态性(SNP)位点变异.结果:所有抽提DNA的吸光度比值(A260/A280)均在1.7～2.1间,电泳条带清晰,可检测出SNP位点变异.与保存1～2年者相比,储存3年或以上的标本NF-κB P65 mRNA与蛋白表达均有下调(P=0.03,P<0.01).结论:组织样本低温保存在5年范围内,其DNA分子的完整性与质量均未受影响;RNA与蛋白质分子在低温保存1～2年内尚不影响癌基因表达的分析结果,但低温保存3年或以上的标本中RNA及蛋白质均有不同程度降解.
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正常人颌骨组织冻存后活性评估及组织库的建立
目的:体外实验评估正常人颌骨冻存后的生物活性变化,初步建立颌骨组织库,探讨骨组织活性冻存后用于骨缺损修复的可能性.方法:选择15～80岁的捐献者(于上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔外科行阻生牙拔除术等牙槽手术的患者),术中无菌条件下用超声骨刀取骨.骨块处理后,置于含10％二.甲基亚砜(dimethyl Sulphoxide,DMSO)的冻存保护液中,无菌独立包装,行慢速梯度降温至-80℃.登记必要信息后,保存入-80℃深低温冰箱,建立骨组织库.通过检测不同冻存时限(0、1、6、12个月)骨块来源的成骨系细胞爬出时间及集落形成率、形态变化、增殖活力、碱性磷酸酶合成能力、体外矿化能力、成骨相关基因表达能力、凋亡情况、染色体变异情况、细胞衰老情况等,研究低温冻存对骨组织生物活性的影响.使用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析.结果:不同冻存时间骨块组织块培养法均能观察到细胞集落形成,形态无明显变化;增殖活力、碱性磷酸酶合成能力、体外矿化能力、成骨相关基因表达能力、染色体变异情况、细胞衰老等与新鲜对照组比较无显著差异(P＞0.05).结论:低温冻存对人颌骨组织的体外生物学功能影响甚微,冻存颌骨组织库用于自体骨缺损修复或组织工程骨构建具有可行性.
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人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的表达
目的:探讨人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)端粒酶活性的表达以及深低温冻存和向脂肪细胞诱导分化对基因表达的影响.方法:联合应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离人hMSCs,传代培养.深低温冻存hMSCs或诱导其向脂肪细胞分化,以TRAP(Telomerase repeat amplification protocol assay) 法分别检测新鲜的不同传代次数的hMSCs、冻存复苏后培养的hMSCs和诱导分化为脂肪细胞的hMSCs的端粒酶活性.结果:用TRAP法检测hMSCs(n=19)端粒酶活性(RTA)是(1.46±0.67)%,分化成脂肪的hMSCs(n=3)的RTA为(11.80±2.52)%(P<0.001);不同传代次数MSCs端粒酶活性的比较中,早期hMSCs(n=10)的RTA为(1.46±0.83)%,晚期hMSCs(n=9)的RTA为(1.46±0.47)%(P=0.99);在低温冻存对hMSCs端粒酶活性的影响中,新鲜的hMSCs(n=13)的RTA为(1.41±0.44)%,低温冻存的hMSCs(n=6)的RTA为(1.57±1.07)%(P=0.64).结论:hMSCs的端粒酶呈阴性,传代培养和低温冻存不影响基因表达水平.向脂肪细胞分化后hMSCs端粒酶活性表达水平增高,其确切机制尚需进一步研究.
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不同冻存液及降温方式对心脏瓣膜组织学及免疫原性的影响
目的：探讨液氮冻存心脏瓣膜的合适冻存保护剂及降温方式。方法将健康捐赠者的心脏瓣膜剪切为7份：新鲜对照组1份，冻存液 A、B、C 3个组每组2份，分别为－80℃直接降温组（G1组）和程控降温仪缓慢降温组（G2组）。采用苏木精－伊红染色、弹力纤维染色、Masson 染色法观察显微结构变化，透射电子显微镜（TEM）观察超微结构变化，采用 Western blotting 法及免疫组织化学法检测瓣膜表面人类白细胞抗原复合体（HLA）的相对表达量，比较各组瓣膜组织免疫原性。结果低温冻存会造成瓣膜组织结构损伤，使用含 DMSO 和硫酸软骨素的冻存液 B 组结构完整，组织损伤小，HLA-I 蛋白的表达明显下调；G2组与 G1组相比，胶原纤维着色偏浅，纤维排列更加紊乱，但 HLA-I 蛋白的表达相对较低。结论同时含有 DMSO 和硫酸软骨素对冻存组织保护效果好，免疫原性低。－80℃直接降温更有利于胶原纤维的保存，但免疫原性高于程控降温法。
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低温冻存对牙髓干细胞生物学特性的影响
目的:研究低温冻存(cryopreservation)对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)生物学特性的影响.方法:取牙髓组织进行干细胞分离培养,用流式细胞仪、细胞增殖检测以及多向诱导分化对比研究未低温冻存与冻存1年后复苏的DPSCs自我更新和多向分化潜能之间的差异.结果:低温冻存对DPSCs的干细胞表面标记分子、增殖以及成骨和成脂分化均无显著影响.结论:低温冻存对DPSCs生物学特性无显著影响,是长期进行干细胞储存的可行方法.
