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弓形虫P30与佐剂CTA2/B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析
目的构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组P30-CTX 蛋白奠定基础. 方法 PCR 扩增P30-CTX 复合基因,产物回收后与pMD-18T 载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,经氨苄抗性筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-P30-CTX;克隆载体与表达载体双酶切后,回收1 313 bp 的P30-CTX 基因,亚克隆入酵母表达载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZαA-P30-CTX.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.使用生物信息软件分析P30-CTX 复合基因,预测编码蛋白结构.结果重组质粒经PCR 可得1 313 bp 的特异条带,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切获得1 313 bp和3 085 bp的条带,与预期大小一致,测序结果证实为pGAP-P30-CTX 基因,序列分析同源性为99.82%,P30-CTX蛋白结构折叠无明显改变. 结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,预测毕赤酵母表达系统对P30-CTX 的抗原性不会产生影响.
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人源性抗HBsAg单链Fab基因在酵母中的表达
抗乙肝表面抗原的人源性抗体(Fab)在临床上有防治乙型肝炎病毒的应用前景,如用于预防新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播和治疗性乙肝制剂等.本文将噬菌体抗体库筛选得到的人源性抗HBsAg Fab抗体基因,通过重叠PCR的方法借Linker将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建单一的链,即单链Fab(Single chain Fab)基因,并插入到酵母表达载体pPICZαA中.将构建的表达载体质粒pPICZαA-HL线性化,通过LiCl转化法转化毕赤酵母GS115,利用ZeocinTM抗生素筛选重组酵母,并用高剂量的ZeocinTM平板来筛选多拷贝整合有融合L、H链基因的重组酵母.
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HBeAg肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆
目的:HBeAg被认为与HBV引起免疫耐受、免疫系统功能障碍有关.筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法:应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌,接种在氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBeAg基因并在酵母细胞中表达,与肝cDNA文库配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落39个,其中有5个未知基因,3个含金属硫蛋白2A基因的菌落,8个补体8 α基因,1个补体因子H,1个补体1q,1个维甲酸受体应答元件2基因、2个细胞色素b基因、3个铁蛋白轻链,2个NAD(P)H脱氢酶亚基,1个3-羟基类固醇表位酶,1个3-羟基,3-甲基戊二酰辅酶A合成酶,1个双-特异性酪氨酸-Y-磷酸化调节激酶1A转录子突变体,1个Syndecans-1,3个2胺氧化酶,4个醛缩酶B,1个CD81,1个ATP合成酶6基因.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒e抗原的结合蛋白,为进一步研究HBeAg在病毒装配、分泌、影响宿主免疫系统功能等方面的具体作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选HBcAg肝细胞结合蛋白基因
目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中含金属硫蛋白A2基因的菌落有2个、未知基因4个、补体8 α基因1个、NAD(P)H脱氢酶亚基1个、维甲酸受体应答元件2基因1个、细胞色素c氧化酶基因1个、细胞色素b基因1个、DAZ相关蛋白2基因2个、线粒体核蛋白L41基因2个、人血白蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选HCV E1蛋白结合的肝细胞蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与HCV E1蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV E1基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:获得了19个与E1蛋白特异性结合的阳性克隆,其中16个克隆为已知蛋白基因和3个克隆为未知功能蛋白基因.结论:成功克隆出与丙型肝炎病毒E1蛋白结合的肝细胞蛋白,为进一步研究HCV E1在HCV致病中的作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV核心蛋白编码基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV核心蛋白编码基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落17个,其中肿瘤高甲基化1基因3个,编码线粒体蛋白的DNA聚合酶γ基因1个,乙酰辅酶A合成酶3基因1个,假定翻译起始因子基因1个,趋化因子受体5基因1个,线粒体核糖体蛋白L41基因1个,Kyot结合蛋白基因1个,Ran结合蛋白基因1个,真核细胞翻译延伸因子2基因2个,未知基因5个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBV核心蛋白在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP6蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV NS3TP6蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HCV NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个,其中3个人类白细胞CDl4抗原,1个人类免疫球蛋白入轻链,3个人类推定蛋白基因(ACl24014,AC097504,AC023785).结论:成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体构建及表达
目的:为进一步探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的功能,在真核生物酵母细胞中表达X基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)的方法以HBV ayw亚型全序质粒pCP10为模板扩增X基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoRI和PstI双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBKT-7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析,以明确HBxAg是否在其中表达.结果:成功地扩增出HBx基因,测序鉴定符合Gene Bank报告序列;酶切回收的HBx基因成功地克隆入酵母表达载体pGBKT-7并转化入酵母细胞AH109中,Western免疫印迹显示X基因在酵母细胞中表达,表达产物在胞内存在,相对Mr为35000左右结论:成功地构建了HBxAg在酵母表达载体,并在酵母细胞中表达
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乙型肝炎病毒包膜大蛋白的自激活
目的:构建乙型肝炎病毒包膜大蛋白的酵母表达载体,研究其自激活作用.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV包膜大蛋白(LHBs),前-S1蛋白(pre-S1),前-S2蛋白(pre-S2)及主蛋白(SHBs)的编码基因,并在其5'端引入EcoRI/BamHI内切酶位点,分别连接入酵母表达载体pGBKT7中,构建酵母表达质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后分别铺于含有X-α-半乳糖的营养缺陷型培养基SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade上进行自激活验证(蓝/白筛选).结果:成功克隆出编码各种HBV包膜蛋白的基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,转化了pGBKT7-LHBs和pGBKT7-preS1的AH109酵母细胞在两种营养缺陷型培养基上均可正常生长,并且可以产生α-半乳糖苷酶从而在铺有X-α-半乳糖的培养基上呈现蓝色,而转化了pGBKT7-preS2和pGBKT7-SHBs的细胞只能在SD/-Trp的培养基上生长,且没有变蓝.结论:LHBs可以作为反式激活子发挥作用,代替GAL4蛋白的激活域来激活GAL4上游激活序列(GAL UAS)和TATA盒,从而激活了下游报告基因(ADE2,HIS3,MEL1和LacZ)的表达,并且其自激活作用来自于前-S1结构域.
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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白新基因C-12的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于细胞核和胞质中,对于病毒前基因组RNA装配入核壳体是必须的,HBcAg还是HBV介导体液免疫反应和CD4+T细胞免疫反应的重要抗原,寻找人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因,是研究HBcAg生物学功能的重要途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-d-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank的信息设计新基因的引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录PCR扩增出C-12#新基因的完整序列,连入另一酵母表达载体pGADT7,并转化进酵母细胞Y187,再次与转化了诱饵质粒的酵母细胞AH109配合(回交),以进一步证实HBcAg与C-12#新基因编码蛋白的结合作用.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中的表达,配合后选出既能在四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中未知基因4个.用自行设计的引物成功地从HepG2细胞的mRNA中扩增出C-12#新基因的完整序列,回交实验证实二者之间的结合作用.结论:成功克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白,发现未知功能基因,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV基因组中的前-X基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV的前-X基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,配合后选出在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落19个,其中5个是人铁蛋白;1个是人的胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3);1个是人醛缩酶B;1个是人糖基化磷脂酰肌醇锚定结合因子1(GPAAl);1个是人血红素结合蛋白;1个是人C1酯酶抑制子(C1-INH);1个是人玻连蛋白;1个是人电压依赖性阴离子通道1(VDACl);1个是丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin);1个是人梭素;1个是人纤溶酶原(PLG);3个是人假想蛋白;1个是RP11-542M13克隆,位于染色体16.结论:成功克隆出前-X的结合蛋白,为进一步研究HBV的前-X蛋白的作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选人白细胞中与乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因
目的:筛选并克隆人白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,进一步探讨HBxAg的生物学功能.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落50个,其中含真核翻译延伸因子2基因20个,真核翻译延伸因子1基因1个,真核翻译起始因子3基因2个,急性髓样白血病MTG8蛋白基因2个,髓样关联分化蛋白基因1个,髓样分化主反应蛋白基因1个,皮肤T细胞淋巴瘤肿瘤抗原基因1个,大组织相容性复合物Ib抗原基因3个,白细胞抗原CD37基因1个,慢性白细胞性白血病相关抗原基因1个,α白细胞整联蛋白基因1个,生长停止和DNA损伤诱导因子34基因1个,转录变异因子1基因2个,蛋白磷酸酶1调控抑制因子15A基因1个,单核细胞系胞苷脱氨酶基因1个,巨噬细胞钙离子依赖型凝集素2基因1个,KIAA1949蛋白基因3个,尿激酶型血浆素原激活剂基因1个,GDP分解抑制因子基因3个,软骨素4磺基转移酶基因1个,锌指蛋白1A亚目基因1个和未知蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒X蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBxAg的生物学作用提供了新的线索.
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应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与NS5ATP1结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin(MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15;1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因.结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因
目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术,筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1个,RNA多聚酶Ⅲ 3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个.结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中HCV NS3蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS3基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS3基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落18个,其中4个真核细胞翻译延伸因子2;2个免疫球蛋白λ轻链;1个肌动蛋白β;1个铁蛋白轻多肽;1个(丝裂原)活化蛋白激酶3;2个肌球蛋白因子1;1个白介素2受体β;1个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6;1个组织蛋白酶S;1个2'-5'寡腺甘酸合成酶类似物;1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个CNN2;1个新基因.结论:成功克隆出HCV NS3的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中HCV核心蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV核心蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出核心蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α--半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共6个,其中2个高尔基复合体关联蛋白1,1个Ran结合蛋白M,1个pellino同族体2,2个未知功能蛋白基因(KIAA1949).结论:成功克隆出丙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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丙型肝炎病毒NS2基因酵母双杂交"饵"载体构建及表达
目的:丙型肝炎病毒NS2蛋白在病毒蛋白加工中起到自裂蛋白酶的作用,但是对人体的作用还不清楚.为探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCVNS2基因.方法:用聚合酶链反应(PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV-1为模板扩增HCV NS2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Westem免疫印迹分析.结果:成功构建HCV NS2基因酵母表达载体称为pGBKT7-NS2,Western免疫印迹显示了HCV NS2在酵母细胞中表达.表达产物在胞内存在,相对分子质量23kD左右,表达量占细胞总蛋白的4%左右.结论:我们成功在酵母细胞中表达了HCV NS2蛋白.为以后研究NS2蛋白对人体的作用打下了基础.
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乙型肝炎病毒E抗原结合蛋白E-19的猴同源基因的克隆化与序列分析
目的:乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对-HBV的感染和复制都不是必须的,普遍认为他与HBV引起免疫耐受,免疫系统功能障碍有关.应用酵母双杂交技术我们克隆了人肝细胞cDNA文库中与HBeAg相互作用蛋白的基因E-19,应用生物信息学技术克隆猴的E-19同源基因.方法:应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,提取阳性菌落并测序,确定人E-19基因序列,利用生物信息学技术克隆猴的E-19同源基因,并进行编码产物的序列分析.结果:成功克隆出人的HBeAg结合蛋白新基因E-19.应用生物信息学技术,确定克隆了猴E-19同源基因,编码基因全长378 nt,编码产物由125 aa组成.结论:成功克隆出人的HBeAg的肝细胞结合蛋白E-19基因,并发现、确定了猴E-19的同源基因,为研究E-19基因的结构与功能、表达与调控、生物学意义以及在病毒性肝炎发病机制中的作用奠定了基础.
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淋巴细胞内与乙型肝炎病毒X蛋白结合的新蛋白X-30编码基因的克隆
目的:为探讨HBxAg在HBV致病过程中的作用,筛选并克隆人淋巴细胞cDNA文库中与HBxAg有相互作用的蛋白基因.方法:利用酵母双杂交系统3筛选并克隆人淋巴细胞cDNA文库中与HBxAg有相互作用的蛋白的基因.将HBxAg编码基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋巴cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,双重筛选阳性菌落,提取质粒并测序,结果进行生物信息学分析,发现其中有1个未知基因.根据GenBank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为X-30,在GenBank中注册,注册号为AY280722.结果:X-30基因的编码序列全长为315个核苷酸(nt),编码产物由103个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBxAg与淋巴细胞结合蛋白新型基因X-30的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg的分子生物学机制及探索新型治疗技术奠定了基础.
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应用白细胞cDNA文库的酵母双杂交技术筛选HCTP4结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HCTP4蛋白结合的蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCTP4基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HCTP4基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-ga1)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落44个,其中25个免疫球蛋白λ轻链;6个来自RP11-189K21克隆的人DNA序列;4个来自RP11-507C10克隆的人DNA序列;2个人BAC克隆RPCI11-75L1;1个人BAC克隆RP11-21M10;1个人遍素酶智能弹(MIB);1个来自RP11-867O8克隆的人DNA基因;1个来自RP3-509I19克隆的人DNA序列;1个小核糖核蛋白G;1个UMP-CMP激酶;1个新基因.结论:成功克隆出HCTP4的结合蛋白,为进一步研究丙型肝炎病毒(HCV)的作用提供了新线索.
