首页 > 文献资料
-
阻断肝再生增强因子表达对HepG2细胞转化生长因子-α及表皮生长因子受体表达的影响
目的 用RNA干扰技术阻断人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)表达,观察人肝癌细胞HepG2中转化生长因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α)及表皮生长因子受体(epidermal growth fac-tor receptor,EGFR)的表达是否受影响,以阐明hALR在促进肝癌细胞生长的相关细胞因子网络中的作用. 方法 将构建好的人肝再生增强因子siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B分别转染至HepG2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,计算转染效率.免疫细胞化学法检测转染细胞中hALR表达,确定抑制效果.根据转染质粒的不同,将HepG2细胞分为3组:转染组(转染pSIALR-A)、阴性对照组(转染pSIALR-B)和空白组(未转染重组质粒).放射免疫法检测阻断肝再生增强因子后各组细胞培养上清中TGF-α水平,Western blot法检测阻断肝再生增强因子后各组细胞EGFR蛋白的表达. 结果 转染组、空白组和阴性对照组TGF-α分别为(5.27±0.86)pg/ml、(7.92±2.65)pg/ml和(6.50±1.28)pg/ml,转染组与空白组、阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);EGFR相对表达量分别为0.946±0.136、1.115±0.606和1.131±0.509,转染组与空白组、阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05). 结论 在促进肝癌细胞生长的细胞因子网络中,肝再生增强因子除了可以直接刺激肝癌细胞增殖外还可通过上调TGF-α及EGFR的表达水平参与肝癌的发生、发展.
-
人肝细胞离线混合生物人工肝治疗慢加急性肝衰竭一例
应用转染人肝再生增强因子(hALR)基因的Hep G2细胞筛选出一株肝细胞作为生物材料,并建立生物人工肝支持系统,经检测具有良好生物合成及转化功能.我们采用离线混合生物人工肝治疗慢加急性肝衰竭1例,报道如下.
-
筛选与克隆肝再生增强因子结合蛋白的基因
目的:人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是一种蛋白质,组织分布比较广泛,功能多样,在肝脏再生过程起一定的作用,但是其对于再生作用的机制还不清楚,采用酵母双杂交体系寻找与ALR相互作用的肝细胞蛋白,探讨ALR的生物功能.方法:应用酵母双杂交系统3,构建ALR诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有x-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析.结果:筛选出36个与ALR特异性相互作用的克隆,其中14个为金属硫蛋白,12个为人血清白蛋白,3个为硒蛋白P,1个是与GenBank中基因组数据库hgts中DNA序列(AC099651)高度同源的未知功能基因.结论:初步克隆了与ALR肝结合蛋白基因,根据所克隆到的基因,对以后研究ALR的功能有一定的提示作用;为以后研究这些能与ALR相互作用的基因在肝细胞中的生理功能奠定了基础.
-
人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达
目的从人胎肝cDNA文库中克隆出人肝再生增强因子(human augmenter of liver, regeneration, hALR),并实现hALR在毕赤酵母中的表达.方法利用PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,亚克隆到pPIC9K的α因子下游并置于AOX1启动子控制下,构建成含有ALR基因的酵母表达载体.转化酵母细胞后,挑选出能在浓度为4.0 g@L-1的G418平板上生长的His+的重组酵母,利用PCR鉴定是否插入了hALR基因.重组酵母的表达在甲醇培养中进行,并利用SDS-PAGE分析hALR的表达.结果 PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,实现了其在酵母中的整和表达.结论 hALR在毕赤酵母中的表达是可行的.
-
基因表达谱芯片技术筛选肝再生增强因子反式调节基因
目的:为了阐明人肝再生增强因子(augmenter of liverregeneration,ALR)的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)扩增出ALR编码区DNA,常规分子生物学技术构建ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ALR,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,ALR的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3.1(-)-ALR构建正确.ALR在HepG2细胞中的表达以Westernblot杂交技术得到证实.对于ALR重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,2种基因的表达水平上调,24种基因的表达水平下调.这些基因包括淀粉酶α、肿瘤坏死因子受体、金属蛋白酶1组织抑制因子、性激素相关蛋白等基因,相信这些类型的基因在ALR所发挥的生物学效应起到重要的作用.结论:ALLR于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解ALR对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.
-
抗人肝再生增强因子抗体识别部位的确定
目的:确定抗人肝再生增强因子单克隆抗体所识别的抗原表位.方法:采用蛋白质预测软件预测人肝再生增强因子的抗原决定簇,根据预测结果合成肽进行竞争ELISA验证单克隆抗体所识别部位.结果:人肝再生增强因子的第6～15,68～80以及105～112位氨基酸残基是其抗原表位.结论:采用计算机软件预测,并在此基础上经合成肽验证的方法是一种可靠的抗原表位确定方法.
-
人肝再生增强因子CXXC结构域与生物学活性的关系
目的:初步探讨人肝再生增强因子蛋白 (human augmenter of liver regeneration protein, hALRp) CXXC结构域与生物学活性的关系.方法:根据酶催化反应中巯基浓度的变化,测定目的蛋白巯基氧化酶活性;采用GST-pulldown方法测定目的蛋白与GST-Na+,K+-ATPase融和蛋白体外相互作用;用MTT法检测目的蛋白促进成人肝细胞HL-7702增殖情况;探讨hALR与hALR-C65A(hALRp的CXXC结构域突变)蛋白活性差异.结果: 在巯基氧化酶活性实验中,酶活性以转换数 (TN) 表示,hALR组TN=1.25±0.21,而hALR-C65A组TN=0,与hALR组比较差异有显著性 (P＜0.05).但hALR-C65A与GST-Na+,K+-ATPase融和蛋白体外相互作用和促进肝细胞增殖活性与hALRp比较无明显变化. 结论:hALRp的CXXC结构在巯基氧化酶活性方面有重要作用,但该结构改变并不影响hALRp与Na+,K+-ATPase的相互作用和促进肝细胞增殖活性.
-
人肝再生增强因子对人外周血单个核细胞增殖的影响及其机制
目的 探讨人肝再生增强因子(hALR)对人外周血单个核细胞(PBMC)增殖的影响及其机制.方法 梯度离心分离PBMC,将细胞分为正常对照组、刀豆蛋白A(ConA)(5 mg/L)组和ConA(5 mg/L)+hALR(30 mg/L)组,分别培养10 min、30 min、1 h、2 h、4 h后,MTT法检测各组各时间点细胞增殖水平,钙荧光指示剂法检测细胞内游离Ca2+浓度的变化,Western blot 法检测细胞内胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化程度.结果 4 h内,各组细胞的增殖水平差异无统计学意义,但ConA组细胞增殖水平已表现出逐渐升高的趋势.正常对照组细胞内Ca2+浓度在加入Fluo-3/AM后2 h达高峰,ConA组1 h达高峰,ConA+hALR组10 min达高峰.正常对照组细胞内磷酸化的ERK随培养时间的延长而逐渐减少;ConA组细胞内磷酸化的ERK在30 min达高峰,之后逐渐降低;ConA+hALR组细胞内磷酸化的ERK在2 h前明显低于ConA组.结论 hALR可能通过影响细胞内Ca2+憾度的变化峰值和磷酸化的ERK,来抑制人PBMC的免疫功能,从而影响其增殖.
-
甲醇流加策略对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子的影响
考察了5L发酵罐中三种甲醇流加策略(恒溶氧、恒比生长速率和恒甲醇浓度)对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子(hALR)的影响.控制恒定甲醇浓度为10g/L诱导时,甲醇比消耗速率和hALR表达速率显著高于其它两种流加策略,终hALR表达水平为360mg/L.
-
重组人肝再生增强因子在体外能刺激HTC肝癌细胞DNA合成
在成功克隆人肝再生增强因子(hALT)cDNA的基础上,本研究将人ALR编码区cDNA亚克隆于真核瞬间表达质粒pCDNA I,构建了真核表达质粒pCDNA I-hALR,转染cos-7细胞后,表达产物生物活性检测表明:真核表达的hALR在体外能刺激HTC肝癌细胞增殖,这一体外活性的确定为重组人ALR的纯化提供了简洁、可靠的检测方法.
-
重组人肝再生增强因子可增强大鼠肝星状细胞间质胶原酶基因的表达
目的了解重组人肝再生增强因子(hALR)对大鼠肝星状细胞间质胶原酶(MMP13)基因表达的影响.方法在培养的肝星状细胞系中加入200、20、2μg/L 3种浓度的hALR,于8、24、48、72?h 4个时间点收集细胞,提取总RNA;用逆转录定量聚合酶链反应(PCR)方法测定MMP13的基因表达水平.结果高、中、低浓度的hALR 3组肝星状细胞MMP13基因表达水平在8、24、48、72h 4个时间点均明显高于对照组;高值均出现在24～48?h,低剂量组为对照组的3倍,中剂量组为对照组的4倍,高剂量组达对照组的6倍.结论重组人肝再生增强因子对大鼠肝星状细胞间质胶原酶基因表达有明显的促进作用.
-
微囊化和基因修饰的肝细胞移植--人肝再生增强因子(hALR)的原核表达、纯化及生物活性研究
目的:构建人肝再生增强因子原核融合表达载体,并对表达产物进行生物活性研究,从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据,并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础.方法:以pGEM-T-hALR为模板,应用PCR技术扩增出hALRcDNA,克隆入原核融合表达载体pGEX-4T-2,限制性内切酶酶切及测序证实序列正确;转化大肠杆菌JM109:挑取阳性克隆以IPTG诱导表达融合蛋白GST-hALR,融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化后进行凝血酶酶切获得hALR单体;采用3H-thymidine渗入法检测hALR单体的生物学活性.结果:以pGEM-T-hALR为模板,行PCR扩增后,产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,可见380bp特异性条带,符合hALRcDNA阅读框架的大小.构建融合蛋白GST-hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR,经限制性内切酶酶切分析,与理论值相符,测序证明序列正确,片段为正向插入.重组表达质粒转化人肠杆菌JM109.SDS-PAGE电泳分析显示重组菌在约41KD处出现一蛋白条带.纯化、酶切后融合蛋白前体谷胱甘肽S-转移酶约26KD,hALR约15KD.薄层扫描蛋白电泳结果表明,表达的融合蛋白占细菌可溶性蛋白总量的31%.纯化hALR加入原代鼠肝细胞、HepG2细胞培基,细胞DNA合成率较对照组均有显著提高(P＜0.01).结论:成功构建融合蛋白GST-hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR,限制性内切酶酶切及序列测定证明载体插入正确,并成功转化大肠杆菌JM109得阳性克隆.采用含融合蛋白GST的原核表达载体pGEX-4T-2表达hALR,其突出优点在于表达产率高;重组蛋白主要以可溶形式存在于胞质中,融合蛋白的分离纯化筛单易行.纯化分离后所得hALR能刺激体外培养的原代鼠肝细胞、HepG2细胞DNA合成,具有生物活性.
-
人肝再生增强因子融合蛋白表达载体的构建
目的:克隆人肝再生增强因子的cDNA并构建谷胱甘肽巯基转移酶-人肝再生增强因子(GST-hALR)融合蛋白表达载体.方法:根据人肝再生增强因子核苷酸序列,从人胎肝cDNA文库中扩增到hALRcDNA,亚克隆于pUC18载体,核苷酸序列测定证实为hALR;将hALRcDNA亚克隆于pGEX-4T质粒,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆酶切鉴定.结果:重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入相应酶切位点,片段与PCR扩增片段大小相同,碱基序列正确.结论:GST-hALR融合蛋白表达载体的成功构建,为获得较大量基因工程hALR产品用于重症肝炎治疗打下基础.
-
阻断肝再生增强因子的表达对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用
背景与目的:前期研究中已发现人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)在肝癌细胞中呈高表达,在正常肝细胞中几乎不表达,并在体外能刺激肝癌细胞株增殖,而对正常肝细胞无影响.本研究通过运用hALR的siRNA和hALR单克隆抗体阻断人肝癌细胞株HepG2表达,探讨hALR对细胞增殖的影响.方法:设计、构建siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B.将构建的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以计算转染效率.转染48 h后,免疫细胞化学及RT-PCR法检测HepG2细胞中hALR的表达.用3H-TdR掺入法检测hALR的siRNA和特异性单克隆抗体对HepG2细胞增殖的影响.结果:HepG2细胞中有hALR的表达.成功构建了针对hALR基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A.转染入细胞后发现,pSIALR-A能明显抑制hALR的表达(mRNA的表达量减少83%),而随机序列的siRNA却无此作用.hALR的siRNA在体外能显著抑制人肝癌细胞株HepG2增殖,分别转染质粒pSIALR-A和pSIALR-B后HepG2细胞的cpm值为67 687±6 548和104 807±5 713(P＜0.05).抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后,可部分抑制肿瘤细胞自主性生长(P＜0.05).结论:HepG2细胞高表达hALR;针对hALR的siRNA能显著、特异性地抑制hALR表达,进而抑制HepG2细胞的生长.抗hALR单克隆抗体也能部分抑制HepG2细胞自主性生长.
-
人肝再生增强因子抑制层黏连蛋白B1链基因转录活性的研究
肝再生增强因子(ALR)不仅有促进肝细胞再生和抗肝损伤作用,还有一定的抗肝纤维化作用[1].本研究利用生物信息学技术,对层黏连蛋白B1链(LAMB)基因上游调控序列进行分析克隆,采用基因重组技术构建pCAT3-LAMBp报告基因载体,与pcDNA3.1(-)-ALR表达载体共转染COS7细胞,证明ALR的转基因表达对LAMB启动子具有下凋作用,使下游CAT基因的表达减弱.本研究为阐明ALR的生物学作用和抗肝纤维化作用提供新的实验及理论基础.
-
重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定
目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序.利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒.结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同.结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础.
-
利用5'-RACE技术进行人肝再生增强因子相互作用肽cDNA5'末端快速扩增及序列分析
目的:利用5'-RACE技术进行人肝再生增强因子(hALR)相互作用肽cDNA5'末端快速扩增并进行序列分析.方法:按照5'-RACE试剂盒(Takara)操作流程进行hALR相互作用肽cDNA5'末端快速扩增,用BLAST技术对扩增序列进行生物信息学分析.结果:成功获取487bp的5'-RACE反应产物,其中5'端延伸了275bp,同源序列分析表明与人Citron激酶mRNA高度同源.结论:5'-RACE技术可以用于快速有效扩增已知部分cDNA序列的5'末端,Citron激酶可能是与hALR具有相互作用的蛋白.
-
抗人肝再生增强因子单克隆抗体对人肝癌细胞株HepG2增殖活性的影响
目的:检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达,利用hALR特异性的单克隆抗体(anti-hALR McAb)结合hALR,观察其阻断hALR的作用后,对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖活性的影响.方法:用免疫细胞化学以及RT-PCR的方法检测HepG2细胞hALR蛋白及mRNA的表达;用3H-TdR掺入法检测hALR特异性单克隆抗体中和hALR后HepG2细胞的增殖情况.结果:①HepG2细胞有hALR的表达.②抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后可部分抑制肿瘤细胞自主性生长.结论:抗hALR单克隆抗体能部分抑制肿瘤细胞自主性生长;hALR通过自分泌方式参与了肝癌细胞的自主性生长.
-
人肝再生增强因子DNA免疫的实验研究
目的:构建人肝再生增强因子(hALR)真核表达质粒,免疫家兔,获得抗hALR多抗血清.方法:将已构建的人肝再生增强因子(hALR)重组质粒PET11-hALR,经PCR扩增,亚克隆人真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-hALR重组质粒.中量制备pcDNA3.1-hALR重组质粒及pcDNA3.1对照质粒,以1.08mg/只免疫家兔,取血并分离血清,进行蛋白质Western blot印迹分析.结果:构建了pcDNA3.1-hALR真核表达质粒,此重组质粒诱发了家兔抗hALR抗体的产生.结论:说明构建的重组质粒在体内有表达能力,为进一步研究hALR的生物学活性及某些疾病的治疗奠定了基础.
关键词： 人肝再生增强因子 DNA免疫 Western blot -
利用噬菌体随机肽库筛选人肝再生增强因子特异结合肽及其抗肝癌作用的研究
目的 利用噬菌体随机肽库筛选人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)特异结合肽并研究其抗肝癌作用.方法 以hALR为靶分子,利用Ph.D.TM噬菌体肽展示系统筛选出与hALR特异性结合的单克隆噬菌体,ELISA法鉴定筛选出的单克隆噬菌体与hALR的结合性,对特异性结合噬菌体DNA中插入片段进行PCR扩增、测序及短肽合成,MTS法检测特异结合肽对人HepG2肝癌细胞增殖的影响,观察特异结合肽对裸鼠人HepG2肝癌移植瘤生长的影响.结果 经过3轮生物淘筛,特异性结合噬菌体得到富集;筛选到的单克隆噬菌体与hALR结合具有特异性(与对照组比较P＜0.05);特异结合肽在体外能抑制人HepG2肝癌细胞增殖(24 h抑制率为46.2％ vs 6.5％,P＜0.01;48 h抑制率为23.6％ vs 5.9％,P＜0.05),在体内能抑制裸鼠人HepG2肝癌移植瘤生长[(1.250±0.512) cm3 vs (4.590±0.398) cm3,P＜0.01;(1.100±0.453)gvs (3.794 ±0.299)g,P＜0.01];该特异结合肽免疫小鼠后机体内无相应抗体检出,且对裸鼠的重要脏器组织结构及功能无明显损害.结论 利用噬菌体肽库筛选到hALR特异结合肽,该短肽通过阻断hALR促肝癌细胞增殖作用,能抑制人HepG2肝癌细胞在体内外增殖,达到抗肝癌的作用,同时产生较低的免疫原性及毒性损害.
