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合并HIV感染肺结核患者Mtb的MLVA与PFGE法基因分型对比研究
目的 对比PFGE和MLVA两种不同分型方法用于大理地区合并HIV感染肺结核患者Mtb临床分离株基因分型的优劣. 方法 选取大理地区27株合并HIV感染肺结核患者Mtb临床分离株,采用PFGE和MLVA两种方法进行基因分型,应用BioNumerics(6.6)软件进行聚类分析. 结果 PFGE法将27株Mtb分为5个基因群,其中主要优势基因群为A群(15株)包括H37Rv,D=0.698;MLVA法将27株Mtb分为4个基因群,其中主要优势基因群为Ⅰ群(8株,包括H37Rv减毒株)和Ⅱ群(9株).D=0.999;对比分析显示MLVA法分辨力高于PFGE法. 结论 MLVA法与PFGE法相比更适合于大理地区合并HIV感染肺结核患者Mtb的基因分型.
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福建宋内志贺菌临床分离株MLVA分型的初步研究
目的 评价多位点可变数目串联重复序列分析(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)对福建地区宋内志贺菌的分型能力,为了解宋内志贺菌分子流行病学特征及疫情暴发时病原的溯源提供分析方法和基础数据. 方法 选择8个VNTR(Variable Number of Tandem Repeats)位点对68株临床分离株宋内志贺菌进行PCR扩增和毛细管电泳,利用BioNumerics软件进行聚类分析并构建小生成树(Minimum spanning tree,MST),结合流行病学资料分析分型结果. 结果 68株宋内志贺菌经MLVA分型后遗传关联度在20.647％～100％之间,按照100％的相似水平可分为66个MLVA型,呈遗传多态性,分辨系数为0.9986;有6个优势基因群(G1～G6),表现出时间地区聚集性.在小生成树中,芗城分离株显示不同程度的亲缘关系,形成本土流行的优势克隆群;新罗分离株来源分散,存在少数优势基因簇. 结论 福建临床分离株宋内志贺菌具有基因多态性,MLVA方法对该菌有较好的分型能力,可用于研究菌株间的亲缘关系.
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贵州省黑线姬鼠钩端螺旋体分离株MLVA分型研究
目的 采用多位点可变数目串联重复序列分析技术(MLVA)分析贵州省黑线姬鼠钩端螺旋体(简称钩体)分离株的分子流行病学特征,为贵州省钩体病的防控提供依据. 方法 采用硅胶膜型TM细菌基因组DNA提取试剂盒提取56株致病性钩体DNA,选择7个可变数目串联重复序列VNTR位点进行PCR扩增,扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统成像并计算各VNTR位点的扩增长度,分析菌株各VNTR位点的重复数目;采用BioNumerics软件分析,用UPGMA系数分析分离株与参考菌株间的聚类关系. 结果 MLVA分析结果显示,56株钩端螺旋体有VNTR4、VNTR36、VNTR50位点出现重复数目差别,被分为6个MLVA型(A1 、B1 、B2、B3、B4、B5型).聚类分析显示56株钩端螺旋体与参考菌株黄疸出血群56601株聚类关系较近,与其他参考株聚类关系较远. 结论 贵州省近年黑线姬鼠钩端螺旋体分离株均为黄疸出血群,MLVA型别具有多样性.
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广东中山地区铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD2缺失研究
目的 研究耐亚胺培南铜绿假单胞菌外膜蛋白(OprD2)缺失情况.方法 取临床分离的铜绿假单胞菌49株,根据其耐药性分为亚胺培南耐药组(35株)和敏感组(14株),采用PCR方法检测各菌株的OprD2基因.采用ML-VA方法对菌株进行基因分型,分析菌株之间的亲缘关系.结果 49株菌株中,共有8株OprD2基因PCR扩增阴性,缺失率为16.3％ (8/49),其中耐药株缺失率为17.1％(29/35),敏感株缺失率为14.3％(2/14),差异无统计学意义(P＞0.05).MLVA基因分型无成簇菌株存在.结论 广东中山地区临床分离株耐亚胺培南铜绿假单胞菌OprD2缺失率低,对亚胺培南耐药的作用不显著.MLVA分型表明当地尚未发生耐亚胺培南铜绿假单胞菌流行.
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广东地区羊种3型布鲁氏菌基因多态性研究
目的：应用多位点可变数目串联重复序列分型（ multiple locus variable number tandem repeat analysis ， MLVA）技术，初步探讨广东地区羊种3型布鲁氏菌的基因多态性特征分布。方法采用MLVA-16分型技术对广东地区患者分离的羊种3型布鲁氏菌株进行PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳等技术，并应用Bio Numerics（Version 5．0）软件进行布鲁氏菌基因多态性研究。结果43株布鲁氏菌菌株间的MLVA分型相似值介于68．2％～100％，在100％的水平上分成32种基因型别，其中27株（62．8％）为单一基因型，另外16株（37．2％）分属于其他5种基因型，各基因型分别含2～5株菌。结论广东地区羊种3型布鲁氏菌MLVA基因型呈现多态性分布特征，没有出现优势基因型别，单一特有基因型占了62．8％。
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黄疸出血群钩端螺旋体MLVA分型研究
目的 初步探讨MLVA(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis)技术在黄疸出血群钩端螺旋体基因分型中的应用.方法 选取7个VNTR位点,对我国致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取基因组DNA,采用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术检测,应用BioNumerics(Ver-sion4.0)软件进行聚类分析.结果 共对117株钩端螺旋体的7个VNTR位点进行了检测,聚类分析分为3个群(A群、B群、C群)28种基因型,其中A群占11.97%(14/117)、B群占0.85%(1/117)、c群占87.18%(102/117);多态性指数介于0.0831与0.8005之间;MLVA基因型存在明显的地域性.结论 MLVA分型技术可初步对钩端螺旋体进行遗传学分类鉴定,应用该技术,将在钩体病分子流行病学研究中发挥重要的作用.
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MLVA用于新疆部分地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究
目的 探讨结核菌株进行多位点可变数目串联重复序列分析(the multiple locus VNTRanalysis,MLVA).方法 选择2010年至2011年新疆维吾尔自治区第五次结核病流行病学抽样调查资料,采用经典24位点方法进行基因分型.并采用BioNumerics5.0数据库进行基因聚类分析.将结核分枝杆菌原始株,取一菌环溶于400μl TE中悬菌,80℃ lh灭活,12 000r/min离心10 min,弃上清,600μ1 TE重新悬菌,进行多位点串联重复序列分析.结果 新疆99株结核分枝杆菌分为2个基因群:分别为基因群Ⅰ和基因群Ⅱ,基因群Ⅰ 66株(66.7％),基因株Ⅱ33株(33.3％);基因群Ⅰ是北京家族,基因群Ⅰ的66株结核分枝杆菌有65种不同的基因型,有2株结核分枝杆菌属于同一簇,成簇率为1.5％,基因群Ⅱ33株结核分枝杆菌菌株的MLVA图谱不同,成簇率为0.结论 新疆结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,以北京基因型菌株为主,同时还存在一定比例的非北京基因型,应加强对主要流行菌株流行的监控及管理.
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鼠疫菌MLVA分型技术及其应用
鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)是鼠疫的病原菌,鼠疫曾在历史上引发3次世界范围的大流行,给人类和社会发展造成极其严重的影响.近年来,鼠疫仍在动物和人群间有散在流行,因此,世界卫生组织(WHO)已将其列为近20年来重新流行的急性传染病之一.鼠疫菌可分为4个古老的变种,即古老变种(Antiqua)、中世纪变种(Medievalis)、东方变种(Orientalis)及田鼠型(Microtus).根据生化特性以及地理区域的差异,中国的鼠疫菌分为18个生态型[1].随着分子生物学的发展,从基因的角度对鼠疫菌进行分型已成为可能.近年来,有很多分子生物学方法被用于鼠疫菌的分型研究,任何分子分型方法都是建立在病原菌一定的基因组结构特点上.由于指纹图谱的溯源优势使其得以有效推广也因此衍生出大量分型方法[2-3].但是,每种方法各有利弊,实验需综合考虑分型能力、重复性、结果解读、可操作性和经费预算等诸多因素.任何实验方法都是为了服务实验目的,传统的诊断方法存在许多弊端,例如:耗时、低通量、重复性差等缺点.分子分型以其高通量著称,实验结果易于重复,省时、省力,相对多位点序列分析(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)而言,多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)具有显著的低廉、省时的优势,因此,非常适合基层工作开展和普及.例如:核糖体分型(Ribotyping)、插入序列100(IS100)、限制性长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、PFGE、MIST、规律成簇的间隔短回文重复分析(CRISPRs)和MLVA[4-9]等,都已经获得了预期的结果.本文中,作者将详细介绍有关MLVA方法的原理、研究进展以及应用前景等.
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沙眼衣原体基因分型方法研究进展
沙眼衣原体(CT)是导致性传播感染(STIs)的病原体之一.CT基因分型的目的在于了解衣原体的流行分布情况、分析性传播网络和致病机制.以主要外膜蛋白(MOMP)为基础的血清学分型是CT的传统分型方法.随着PCR和基因测序技术的出现,基于核苷酸多态性的基因分型技术成为目前的主流.其中基于omp1基因的限制性片段长度多态性分析(RFLP),可以对CT进行基因分型.而多位点序列分型(MLST)和多位点可变数目串联重复序列分型(MLVA)进一步提高了分型效率,并能提供更多的流行病学信息,但均不能检测混合感染(MIs).PCR杂交技术在检测MIs方面有独特优势.而全基因组测序、纳米技术、高分辨率基因分型等新技术的应用,为科研人员提供更多的细节信息与更快的检测速度.本文简要介绍了多种CT基因分型方法的特点及其应用.
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127株结核分枝杆菌基因分型及耐药相关研究
目的 研究山西省长治及周边地区结核分枝杆菌的基因多态性及基因型与耐药的相关性.方法 收集结核分枝杆菌临床分离株,运用MLVA方法进行基因分型,对8种抗结核药物分别采用比例法进行药敏试验,应用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析.结果 15个位点中Mtub21、MIRU26和ETRE多态性较高(HGI＞0.6),MIRU40、ETRB、MIRU16、ETRD、MIRU23和ETRC位点多态性较低(HGI＜0.3).127株结核分枝杆菌共分为11个基因群102种基因型,90株为独特型,基因群中Ⅰ群所占比例大(80.31％).127株菌株对一线和二线抗结核药物的总耐药率分别为47.24％和23.62％.一线药物中链霉素(40.94％)的耐药率高,乙胺丁醇(6.30％)低.二线药物中左氧氟沙星(14.17％)的耐药率高,丙硫异烟胺(3.15％)低.链霉素的单耐药率高(11.81％);耐多药率为21.26％(27/127);广泛耐多药率为3.15％.Ⅰ群菌株的耐药率与其它菌株的差别无统计学意义.结论 初步证实山西长治及周边地区的结核分枝杆菌具有明显的多态性,Ⅰ群为主要流行群.结核分枝杆菌对二线药物的敏感性高于一线药物.主要流行菌株Ⅰ群菌株与耐药无明显的相关性.
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布鲁氏菌分离株MLVA分子分型鉴定
目的 对牛奶、羊奶以及羊流产胎儿中分离布鲁氏菌进行分型鉴定.方法 采集新疆4个地区牛奶20份,羊奶20份,羊流产胎儿10份,分离培养后,运用VirB8-PCR和布鲁氏菌分子分型PCR(AMOS-PCR)方法对分离株进行布鲁氏菌属、种的鉴定,同时采用MLVA方法对分离株进一步鉴定,并将测定结果与http://mlva.u-psud.fr/数据库提供的布鲁氏菌数据进行比较,结合软件BioNumerics 6.6进行聚类分析.结果 6株分离株均为羊种3型布鲁氏菌,与辽宁省分离羊种3型布鲁氏菌在聚类分析中关系较近.结论 MLVA作为布鲁氏菌基因分型鉴定的一种快速、可靠的方法,为今后布鲁氏菌传染源的追溯及防控措施的制定提供依据.
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大理地区合并 HIV 双重感染者结核分枝杆菌MLVA 法基因分型研究
目的：探讨MLVA基因分型法在云南大理地区合并 HIV双重感染者结核分枝杆菌基因分型中的运用，初步研究其基因型特征。方法选取大理地区61株合并HIV双重感染者结核分枝杆菌临床分离株，采用聚合酶链反应（PCR）分别对VNTR位点进行检测分析，应用BioNumerics（6．6）软件进行聚类分析。结果共对61株合并 HIV双重感染者的结核分枝杆菌的15个VNTR位点进行检测，呈现出明显的基因多态性。各个位点的分辨能力不同，其中MIRU26（0．839）高，MI‐RU4（0．341）低。经聚类分析，61株双重感染结核分枝杆菌菌株可分为5个基因群，61个基因型，以Ⅰ型占比例大占51．6％（32／61）；H37Rv减毒株在Ⅱ型。结论大理地区合并HIV双重感染者结核分枝杆菌VNTR基因存在明显多态性，主要流行菌群为北京家族基因型。
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两种技术在广东地区布鲁氏菌菌株分型中的应用与评价
目的：对脉冲场凝胶电泳方法（PFGE）和多位点可变数目串联重复序列分型（MLVA）两种分子分型方法在布鲁氏菌分型研究中的应用进行比较和评价。方法采用PFGE和MLVA分子分型方法对60株布鲁氏菌地方株和3株标准菌株（16M、544A、1330S）进行分型比较。结果63株菌株间PFGE相似性系数介于72．1％～100％，在94．4％相似水平可区分羊、猪、牛3个种，在100．0％相似水平上可分为14个群29种PFGE型别，分辨力为0．9575；MLVA相似性系数介于16．9％～100％，在52．3％相似水平可区分羊、猪、牛3个种，在100．0％相似水平上可分为8个群47种MLVA型别，分辨力为0．9852。结论PFGE和MLVA均可在一定的相似系数从种的水平区分羊、猪、牛3个种，但不能区分同种异型；两种方法均可用于布鲁氏菌的分子分型，MLVA较PFGE具有稍高的分辨能力。
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MLVA方法在军团菌分子分型中的应用评价
目的 探讨MLVA方法在军团菌分型中的可应用性.方法 选用文献报道的9个军团菌VNTR位点,对我国环境水中分离的81株Lp1型军团菌菌株和2株参考菌株进行分子分型研究,并与PFGE和SBT分型结果进行了比较.结果 81株分离菌株9个VNTR位点的等位基因型别数分别为6,3,4,2,3,3,2,4和7,其中部分菌株的某些位点无扩增产物或产物为非目的 片断.7个位点PCR产物具有重复单元;Lpms3位点PCR产物无重复单元;Lpms31位点部分菌株PCR产物有重复单元,另一些菌株无重复单元.对于具有重复单元的序列,不同菌株间以及同一菌株内各重复单元的序列变异均较大,3个位点存在不完整的重复单元.根据8个位点的PCR产物电泳结果,81株Lp1型分离菌株分为19个MLVA型.通过PFGE和SBT方法,81株Lp1型分离菌株分别分为46种PFGE带型和21种ST型.结论 MLVA方法的分型能力不及PFGE方法,而与SBT方法分型能力相当.但是,MLVA方法操作简单、成本低廉,而且可对培养阴性的标本进行分型,因此,该方法适合在基层推广应用.
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2006-2010年中国鼠伤寒沙门菌分子分型分析
目的 了解近几年我国鼠伤寒沙门菌临床分离株的分子分型特点,为以实验室为基础的食源性暴发的发现提供基线数据.方法 根据国际PulseNet公布的沙门菌PFGE分型方案及鼠伤寒沙门菌多位点MLVA分型方法,对2006-2010年分离自我国7个省(直辖市)的294株鼠伤寒沙门菌进行分子分型分析.结果 294株鼠伤寒沙门菌经XbaⅠ酶切,脉冲场凝胶电泳后,获得87种带型,其分辨能力(D值)为0.905 0.对其中的主要优势带型JPXX01.CN0001菌株76株、JPXX01.CN0006菌株40株和JPXX01.CN0073菌株24株进一步用第2种内切酶BlnⅠ酶切后,分别获得10、22和17种带型.应用MLVA分析,获得198种型别, D值为0.992 9.对流行病学调查显示为鼠伤寒沙门菌暴发病人和食物来源的菌株进行PFGE双酶切及MLVA分型,两种分型方法获得一致性结果,均显示这些菌株具有明显的聚集性.结论 两种分子分型结果显示我国鼠伤寒沙门菌临床分离株具有遗传多样性,MLVA分型方法的分辨能力高于PFGE,在确认鼠伤寒沙门菌引起的暴发事件时,采用需时较短,操作方便的MLVA分型方法可满足菌株聚集性分析.
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福建省布鲁氏菌分离株的分子生物学鉴定
目的 利用分子生物学方法鉴定福建省布鲁氏菌分离株.方法 对布鲁氏菌分离株进行AMOS-PCR和MLVA分型.结果 3株福建省分离株经AMOS-PCR鉴定为羊种,与传统生物学分型一致;MLVA分型将其分为3个基因型,聚类分析鉴定为羊种.结论 AMOS-PCR、MLVA分型可以作为我省布鲁氏菌分离株鉴定的辅助手段.
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泌尿生殖道沙眼衣原体MLVA-ompA分型方法的建立及初步应用
目的:探讨泌尿生殖道沙眼衣原体(Ct)多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)-ompA分型方法的建立及初步应用.方法:共对5株Ct参考株和31株性病门诊男性Ct阳性株进行MLVA-ompA分型.合成针对串联重复次数差异性显著的3个可变数目串联重复序列(VNTR)(CT 1291,CT1299,CT 1335)的引物,优化PCR反应条件,进行PCR扩增,与参考序列比对进行MLVA分型.OmpA分型采用本实验室已建立的巢式PCR方法,扩增ompA基因,通过测序后进行Blast比对判断型别.结果:ompA和MLVA分型方法的分辨率分别为0.83和0.86,MLVA-ompA分型分辨率可达0.96.31株临床Ct株中,29例(93.5％)ompA分型成功,共被分为8个基因型B(0.7％)、D(37.9％)、E(0.7％)、F(10.3％)、G(0.7％)、H(0.7％)、J(20.7％)、K(3.4％).31株临床Ct株MLVA分型全部成功(100％),共检出10个MLVA亚型和18个MLVA-ompA亚型.结论:成功建立了Ct的MLVA-ompA分型方法,该方法可对临床Ct阳性株进行分型分析,与ompA分型方法相比,具有更高分辨率,可作为Ct传统分型方法的补充.
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基于毛细管电泳的金黄色葡萄球菌MLVA分型
目的 建立基于毛细管电泳的MLVA分子分型方法,对食源性金黄色葡萄球菌进行分子分型研究.方法 选取8个管家基因的可变数目串联重复序列(VNTR),利用毛细管电泳技术进行MLVA分子分型.结果 建立了基于毛细管电泳的MLVA分子分型方法,利用该方法对89株食源性金黄色葡萄球菌进行分型,获得46个MLVA分子型.结论 基于毛细管电泳的金黄色葡萄球菌MLVA分子分型方法省时、省力,对操作人员的技术水平要求不高,尤其在处理突发事件时,显现出绝对的优势.
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炭疽芽胞杆菌的基因分型
为了鉴别炭疽芽胞杆菌（ Bacillus anthracis）的基因型，多位点可变数量串联重复序列分析（ MLVA）、单核苷酸多态性分析（ SNP ）和单核苷酸重复序列分析（ SNR ）被广泛应用，并逐渐成为炭疽分型的基本方法，因而对其应用现状进行了综述。
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中国的炭疽杆菌DNA分型及其地理分布
炭疽广泛分布于中国各地,特别是西部地区,并经常造成人畜疾病.在一项合作研究中,用多位点VNTR分析(MLVA)对从1952～1998年自中国主要地理流行区域分离的病人、病畜和土壤等来源的炭疽杆菌进行了基因分型.MLVA分析结果揭示了21种新的基因型,其等位基因组合在以前世界范围分离物的研究中未曾发现.此外,分离物的分群显示,A3b组是地理上广泛分布的基因组,说明该组可能是中国的"地方流行株".而来自古丝绸之路重要贸易中心新疆的大量分离株其基因型特别分散.
