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囊虫病免疫诊断的研究进展
囊虫的诊断除皮肌型患者可采取皮下结节检查确诊外,单纯脑型患者的诊断常根据临床症状、影像学诊断和免疫学检测的结果进行综合判断获得,当临床症状、影像学指标不典型及疾病早期时,诊断往往有一定的困难.免疫学诊断弥补了临床诊断及影像学诊断的不足,具有重要的临床价值.近年来国内外学者对囊虫病的免疫诊断进行了大量的研究工作.诊断试剂的不断更新,免疫检测手段的换代,使得该领域的研究不断推陈出新,在抗原分析与研究方面已日益扩展到了异种抗原、纯化抗原、基因重组抗原等领域;在检测技术上亦从简单的凝集试验涉及到了免疫标记、酶联免疫印渍、杂交瘤制备、DNA重组技术等领域.现将国内外有关研究近况综述如下.
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牛、猪红细胞表面异种抗原改造的比较
把动物红细胞输用给人,即异种输血,可以缓解目前血源紧张的矛盾,但牛和猪的红细胞与人的血浆发生强烈的凝集反应,不能直接输用.本研究首次对牛和猪红细胞表面抗原进行修饰改造,并对改造后的猪、牛红细胞进行比较,从而为开拓丰富来源、安全有效的人血代用品奠定基础.使用基因重组的咖啡豆α-半乳糖苷酶清除牛和猪红细胞表面的主要异种抗原-α-Gal抗原,结合使用化学材料甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰遮蔽牛和猪红细胞表面的非主要异种抗原-non-αGal抗原,以实现对牛和猪红细胞表面异种抗原的改造.结果:改造后的牛、猪红细胞与人混合血浆的盐水凝集反应消失,具有和人红细胞相似的血清学特征;牛红细胞比猪红细胞脆性低,异种抗原的表达量低,及其他的一些特征说明牛红细胞比猪红细胞更适合作为人红细胞代用品.结论:改造后的牛红细胞与人血浆相匹配,有可能成为人红细胞代用品.
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荷斯坦奶牛红细胞作为异种血源的研究
α-Gal抗原是引起异种移植超急性排斥反应的主要异种抗原.本研究探讨新型基因重组α-半乳糖苷酶对荷斯坦奶牛红细胞上的异种抗原的作用.用酶解法清除红细胞表面的α-Gal抗原,用盐水法或抗人球蛋白法进行奶牛红细胞与人血浆的凝集试验,用流式细胞术检测奶牛红细胞表面的α-Gal抗原(FITC-IB4)标记和FITC-IgG标记红细胞的荧光强度.结果表明,盐水法和抗人球蛋白法检测显示,酶解后荷斯坦奶牛红细胞与人混合血清不发生凝集.流式细胞术检测显示,酶解后荷斯坦奶牛红细胞较酶解前其FITC-IB4标记率降低了99.0％,FITC-IgG标记率降低了87.8％.结论:新型α-半乳糖苷酶可以用来清除荷斯坦奶牛红细胞上的α-Gal抗原,且荷斯坦奶牛红细胞的异种抗原主要是α-Gal抗原.酶解法制备的荷斯坦奶牛红细胞可能成为人血替代品.
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新型α-半乳糖苷酶清除动物红细胞表面αGal抗原的研究
异种抗原αGal是引起异种移植免疫排斥反应的重要原因之一.脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶是一种新型的糖苷酶,能够切除支链多糖和直链多糖末端的αGal残基.本研究探讨新型α半乳糖苷酶清除红细胞表面αGal抗原的作用.利用新型的基因重组α-半乳糖苷酶酶解牛、猪、狗、兔红细胞上的异种抗原,并用流式细胞术分析细胞表面的αGal抗原.结果表明,动物红细胞表面的异种抗原αGal被完全或部分清除.结论:新型α-半乳糖苷酶可以用来清除异种红细胞上的αGal抗原,对降低异种移植引起的超急性排斥反应具有潜在意义.
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人类α-1,2-岩藻糖苷转移酶在猪血管内皮细胞的表达及作用
目的:探讨人类α-1,2-岩藻糖苷转移酶(HT)基因在猪血管内皮细胞(PIECs)的表达及意义.方法:将人HT基因重组质粒通过脂质体转染进猪血管内皮细胞,经G418筛选(500mg/L),用流式细胞仪检测HT的表达,表达阳性细胞与人血清共同孵育检测细胞的生存率.结果:流式细胞仪检测结果显示,未经转染HT基因的PIECS的H抗原表达率是13.80%,平均荧光强度很低是32.39,α-Gal表达率是99.98%,平均荧光强度是1347.09;转HT基因的PIECS其H抗原表达率是40.17%,平均荧光强度是143.66,α-Gal表达率是41.15%,平均荧光强度是158.72.转HT基因的细胞在人血清的作用下生存率明显高于未转染的细胞.结论:转染HT基因的PIECs明显提高了H抗原的表达,同时降低了α-Gal的表达,为转基因动物实验探讨克服异种移植超急性排斥反应(HAR)提供理论依据.
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异种抗原瘤内注射对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用
背景:异种抗原的免疫原性比较强,容易引起较强的免疫应答.如果将异种抗原直接引入肿瘤内部,在肿瘤内部引发一系列免疫反应,有可能逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态,达到抗肿瘤的目的.目的:评价人红细胞膜抗原瘤内注射对荷S180肉瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用.方法:复制昆明小鼠S180肉瘤皮下瘤模型,瘤内注射质量浓度为5 g/L的人红细胞膜抗原或生理盐水,连续注射5 d,记录注射前及注射第3,7,14天肿瘤体积变化.同时设肿瘤细胞与人红细胞膜抗原同时接种组、免疫后瘤内注射人红细胞膜抗原组、免疫后瘤内注射生理盐水组.另取60只小鼠复制S180肉瘤皮下瘤模型,免疫及瘤内注射人红细胞膜抗原或生理盐水同前.注射第14天每组处死6只小鼠,肿瘤称质量,行病理学分析,每组剩余小鼠继续观察生存情况.结果与结论:各组小鼠肿瘤体积逐渐增大,第14天人红细胞膜抗原与肿瘤细胞同时接种组、免疫后人红细胞膜抗原瘤内注射组、人红细胞膜抗原瘤内注射组肿瘤体积均小于瘤内注射生理盐水组.瘤内注射人红细胞膜抗原可显著降低肿瘤质量.瘤内注射人红细胞膜抗原后镜下可见肿瘤细胞坏死、淋巴细胞等炎症细胞浸润.未观察到各组小鼠生存期有明显差别.结果表明异种红细胞膜抗原瘤内注射可以抑制小鼠S180肉瘤肿瘤生长.
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异种抗原治疗肿瘤对荷瘤小鼠调节性T细胞的影响
目的 研究异种抗原免疫续贯瘤内注射的方法 对荷瘤小鼠肿瘤局部调节性T细胞数量的影响,及其对肿瘤的治疗作用.方法 利用异种抗原免疫续贯瘤内注射的方法 处理试验小鼠,测量瘤块大小,计算抑瘤率,使用流式细胞术检测肿瘤主要组织相备性合体Ⅰ类(MHC-Ⅰ)类型表达及调节性T细胞的数量,使用ELISA方法 检测瘤内白细胞介素2(IL-2)浓度.结果 实验组小鼠的MHC-Ⅰantigen、CD3+CD8+T细胞以及CD3+CD4+CD25+T细胞的表达率分别为42.45%、22.58%和2.91%,IL-2的浓度为100.6 pg/ml,与免疫对照组和空白对照组之间存在显著性差异(P<0.01).结论 异种抗原免疫续贯瘤内注射的治疗方法 可以上调肿瘤MHC-Ⅰ类抗原,减少肿瘤局部调节性T细胞的数量,有良好的抗肿瘤作用.
关键词： 异种抗原 调节性T细胞 主要组织相容性复合物 白细胞介素2 -
大鼠骨髓间充质干细胞抵抗人血清介导的异种体液免疫杀伤作用及其机制
目的:研究大鼠骨髓间充干细胞(rBMSC)抵抗人血清介导的异种体液性杀伤的作用及其主要机制.方法:分离培养SD大鼠BMSC,将第4代的rBMSC作为实验材料,以大鼠淋巴细胞(rLC)作为对照.采用流式细胞技术,检查两种细胞异种抗原α-Gal的表达情况,体积分数20％正常人血清对两种细胞的杀伤作用、两种细胞分别与正常人血清中天然抗体IgM和IgG的结合情况,以及与正常人血清作用后补体C3c、C4c、C5b-9在两种细胞上的沉积情况.结果:成功分离和培养rBMSC.相对于rLC,rBMSC对人血清介导的异种体液性杀伤具有明显的抵抗作用(P＜0.01);rBMSC上α-Gal的表达显著低于rLC(P＜0.05);rBMSC与人血清中IgG和IgM的结合量显著低于rLC(P＜0.01);与正常人血清作用后,rLC可见显著的C3c、C4c和C5b-9沉积,但rBMSC仅有较少C3c和C4c沉积,两种细胞间比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论:rBMSC能明显抵抗人血清介导的异种体液免疫杀伤作用,其机制可能与rBMSC低表达异种抗原α-Gal及抑制了补体攻膜复合物形成有关.
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兔免疫性冠状动脉炎的实验观察
目的 为研究川崎病提供实验模型.方法 20只日本大耳幼兔随机分为模型组和对照组,各10只.两组分别通过耳缘静脉,在第1和第12天各注射一次牛血清白蛋白和生理盐水.在首次注射后的第6周,行冠脉造影,并在1h内分离冠状动脉,行组织病理学检测和超微结构电镜观察.结果 冠脉造影显示,模型组中3只兔的左侧冠状动脉出现不同程度的扩张或狭窄；组织病理学显示,模型组的冠状动脉均出现内皮增厚、不同程度的炎症细胞浸润,不完整的冠脉内皮；而对照组兔冠状动脉内皮完1整、光滑、均匀；透射电镜显示,模型组的冠状动脉内皮不连续,出现脱落的内皮细胞、肿胀的线粒体、扩张的内质网和中层平滑肌细胞肿胀变性,同时发现部分内弹力膜断裂.结论 牛血清白蛋白可诱导兔产生免疫性冠状动脉炎性病变,该病变与人川崎病冠状动脉的病理学改变具有相似性.
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腺病毒载体介导人KDR胞外段诱导抗小鼠肝癌的免疫效应
目的: 探讨复制缺陷型腺病毒载体(Ad)介导人血管内皮细胞生长因子受体-2(hVEGFR-2或hKDR)胞外段诱导抗小鼠肝癌血管免疫及打破免疫耐受的效果.方法:构建Ad hKDRE,用Ad hKDRE皮内免疫C57BL/6小鼠,7 d后取脾细胞作为效应细胞(E),Hepa 1-6/mKDR作为靶细胞(T),行乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测特异性CTL杀伤活性;给免疫小鼠接种肝癌细胞Hepa 1-6,观察荷瘤小鼠成活情况.结果:Ad hKDRE免疫小鼠1周后,在E:T为100:1、50:1和25:1时,Ad hKDRE诱导的6 h CTL杀伤率分别为(81.5±5.6)%、(68.4±5.5)%和(39.6±3.9)%.Ad hKDRE免疫小鼠1周后接种2×106 Hepa1-6肝癌细胞,观察2个月无小鼠成瘤;接种5×106 Hepa1-6细胞,小鼠无瘤成活率为60%.上述CTL效应和抗成瘤作用在清除CD8+和CD4+ T淋巴细胞后消失.结论:Ad介导异种(人)KDR胞外段能有效地打破小鼠肝癌的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,这种特异性细胞免疫反应是CD4+和CD8+ T细胞依赖性的.
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异种移植研究进展
1954年Murray首次施行同卵双生姐妹间的肾移植获得成功；1959年Murray和Hamburger各自为异卵双生同胞间施行肾移植，受者接受全身照射使移植肾获得长期存活；1962年Murray施行首例尸体肾移植，受者服用硫唑嘌呤获得长期存活。自此，现代器官移植时期正式开始。随着外科技术(血管吻合技术)、组织器官低温保存技术的进步及免疫抑制药物(特别是环孢素)控制排斥反应的成功，临床同种异体移植飞速发展，移植种类逐步扩大到心、肝、脾、肺、小肠、骨髓、骨、关节及胰岛细胞等几乎所有重要脏器和组织，移植对象也扩展到儿童和老人，器官及组织移植已成为拯救脏器终末性病变的惟一有效手段。但随之而来的供体器官短缺已成为全球性的难题，越来越多的患者在等待器官中死去，这使得人们积极探索异种移植的可能性[1]。
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大鼠脂肪来源干细胞抵抗人血清介导的异种体液免疫杀伤作用及其机制
目的 研究大鼠脂肪来源干细胞(rASC)抵抗人血清介导的异种体液性杀伤的作用及其主要机制.方法 分离培养SD大鼠ASC,将2～8代的rASC作为实验材料,以大鼠淋巴细胞(rLC)作为对照.采用流式细胞技术,检测两种细胞异种抗原α-Gal的表达情况,体积分数20％正常人血清对两种细胞的杀伤作用、两种细胞分别与正常人血清中天然抗体IgM和IgG的结合情况,以及与正常人血清作用后补体C3c、C4c、C5b-9在两种细胞上的沉积情况.结果 成功分离和培养rASC,rASC表面标志检测呈CD44阳性、CD45阴性、CD90阳性及主要组织相容性抗原Ⅱ阴性,并成功诱导rASC向成脂细胞和成骨细胞分化.相对于rLC,rASC对人血清介导的异种体液性杀伤具有明显的抵抗作用,其几何平均荧光强度(Gmean)值为(20.42±2.80)％,低于rLC的(51.84±6.70)％(P＜0.01);rASC上α-Gal的表达量为13.97±0.33,显著低于rLC的24.47±3.03 (P＜0.05);rASC与人血清中IgG和IgM的结合量分别为9.4±2.0和5.73±1.0,显著低于rLC的107.2±4.8和27.49±3.9(P＜0.01);与正常人血清作用后,rLC可见显著的C3c、C4c和C5b-9沉积(Gmean值分别为1 924±509.4、177.3±37.17和37.05±7.4),但rASC仅有较少C3c和C4c沉积(Gmean值分别为294.6±38.02和35.23±3.1),C5b-9沉积几乎为阴性(Gmean值为5.63±1.74),两种细胞间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 rASC能明显抵抗人血清介导的异种体液免疫杀伤作用,其机制可能与rASC低表达异种抗原α-Gal及抑制了补体攻膜复合物形成有关.
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转人α-1,2岩藻糖苷转移酶基因在异种移植中的研究
目的研究转人α-1,2岩藻糖苷转移酶基因(HT)在克服超急性排斥反应(HAR)中的作用.方法通过脂质体转染将人HT基因转入猪血管内皮细胞(PIECs)中,利用显微注射建立转HT基因小鼠模型,经流式细胞仪检测转HT基因阳性的PIECs表面抗原及小鼠外周血单核细胞表面抗原的变化.结果转HT基因的PIECs表面的α-1,3半乳糖(α-Gal)比阴性对照下降了50%～60%,H抗原由无表达到44%～78%表达阳性;转HT基因小鼠白细胞表面的α-Gal比阴性对照下降了63%左右,H抗原阳性表达率为95%以上.结论 HT基因在细胞和小鼠体内均有较好的表达,可减少异种抗原与异种抗体的反应,在克服超急性排斥反应中能发挥一定的作用.
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异种骨移植的免疫反应及处理方法的研究进展
当前临床骨移植使用的多为自体骨或同种异体骨,但其来源受到限制.异种骨供源丰富,但移植后的排斥反应为其使用受到限制的主要原因.现对异种骨移植的抗原性和移植后的免疫反应及降低异种骨排斥反应的方法的研究进展进行综述.一、异种骨抗原的主要来源1.天然异种抗原:α-半乳糖基抗原(α-Gal)是公认存在于除旧世纪灵长目以外的哺乳动物体内的异种抗原,α-Gal在骨中的含量相对要少,主要分布于哈佛氏管内皮细胞膜上.Tearle等[1]认为存在非α-Gal的异种抗原.但该抗原是否在骨中分布则还不清楚.
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异种胸腺修饰对淋巴细胞功能的影响
目的 探讨猪-猴异种胸腺修饰对受体淋巴细胞功能可能产生的影响.方法 将猪淋巴细胞注入猴胸腺内,在胸腺修饰前后,分别分组行猪猴单向混合淋巴细胞反应.A组:猪淋巴细胞+猴NK细胞+猴T细胞;B组:猪淋巴细胞+猴T细胞;C组:猪淋巴细胞+猴NK细胞.检测细胞增殖及NK细胞活性变化和干扰素(IFN)-γ及肿瘤坏死因子(TNF)-α水平变化.结果 胸腺修饰后,A组及B组细胞增殖明显抑制(P＜0.05),IFN-γ及TNF-α分泌明显下降(P＜0.05);C组细胞增殖及IFN-γ及TNF-α分泌均无明显差异(P＞0.05).单独胸腺修饰前后比较,A组NK细胞杀伤活性均较C组有明显提高(P＜0.05).结论 胸腺修饰对T细胞可产生一定程度功能抑制,并减少相关细胞因子分泌,对NK细胞分泌细胞因子无影响.T细胞可通过细胞因子在一定程度上提高NK细胞杀伤活性,但抑制T细胞功能对NK细胞活性无明显影响.
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异种器官移植免疫生物学研究进展
异种器官移植是解决器官移植短缺的有效手段之一,猪作为潜在的器官移植供体来源已得到广泛认可,但是要实现猪至灵长类动物的异种器官移植的临床应用需要克服多重免疫生物学障碍.本文以异种器官移植多重免疫排斥反应发生的时间先后为顺序,依次对超急性排斥反应、急性体液异种移植排斥反应和急性细胞排斥反应、血栓性微血管病和慢性排斥反应的研究进展进行了综述.
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Ad介导人AFP和IFN-у协同诱发抗小鼠肝癌免疫效应
背景与目的:原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一.目前对HCC的治疗尚无行之有效的手段.本研究探讨腺病毒(Adenovirus,Ad)载体介导异种甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)和у干扰素(Interferon-gamma,IFN-у)的协同抗肝癌效应.方法:用RT-PCR(reverse transcri-ptase-polymerase chain reaction)方法克隆小鼠IFN-у基因并构建复制缺损型腺病毒编码人AFP和小鼠IFN-у联合表达载体(Ad-hAFP/IFN-у).皮内免疫C57BL/6小鼠7 d后,取脾细胞行51Cr释放实验检测特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)杀伤活性;或给免疫小鼠皮下接种Hepa1-6肝癌细胞,观察荷瘤小鼠成活情况.结果:51Cr释放实验显示,Ad-hAFP/IFN-у免疫小鼠1周后其诱导产生的特异性CTL杀伤活性明显强于Ad-hAFP或Ad-IFN-у单独免疫,在效:靶比(E:T)为10:1时,Ad-hAFP/IFN-у、Ad-hAFP和Ad-IFN-у诱发的CTL杀伤率分别(43.8±5.5)%、(28.2±3.2)%和(12.8±1.9)%;30:1时,为(79.6±6.4)%、(51.9±4.3)%和(15.6±2.3)%以及90:1时(88.2±6.3)%、(62.5±4.8)%和(26.5±2.4)%.荷瘤试验表明,Ad-hAFP或Ad-IFN-у单独免疫小鼠后1周接种5x106 Hepal-6肝瘤细胞,观察2个月.Ad-hAFP免疫组80%的小鼠荷瘤,Ad-IFN-у免疫组小鼠则100%荷瘤;而Ad-hAFP/IFN-у免疫小鼠在接种同样数量的Hepal-6细胞,2个月无小鼠荷瘤,小鼠100%存活.结论:腺病毒载体介导异种AFP能有效地诱发针对小鼠AFP的特异性细胞免疫反应,IFN-у能明显增强这种效应.
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异种抗原免疫序贯瘤内注射对瘤荷小鼠的免疫治疗作用
目的 研究异种抗原免疫序贯瘤内注射对瘤荷小鼠免疫功能的影响及其对肿瘤的抑制作用.方法 使用异种抗原免疫序贯瘤内注射的方法处理小鼠,观察肿瘤大小,利用流式细胞术检测各细胞亚群的比例.用ELISA方法检测肿瘤组织内细胞因子的浓度.结果 各组小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+T细胞数量没有统计学差异.免疫后治疗组中的CD3+CD4+T叮细胞、CD3+CD8+T细胞以及CD3+CD4+CD25+T细胞所占比例分别为54%、22%和2.91%,其中C134+与 CD8+的比值为2.49,与对照组比较有显著差异(P<0.05).治疗组IL-2浓度为100.61 pg/ml,TNF-α浓度是54.11 pg/ml,与各对照组之间均存在显著性差异(P<0.05).结论 异种抗原序贯瘤内注射方法可以增加肿瘤微环境中效应细胞的数量及细胞因子的浓度.减少CD3+CD4+CD25+T调节细胞的表达,具有显著的抗肿瘤作用.
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异种抗原免疫序贯瘤内注射对肿瘤浸润淋巴细胞的影响
目的 研究异种抗原免疫序贯瘤内注射对瘤荷小鼠的治疗作用,以及该方法 对肿瘤浸润淋巴细胞的影响.方法 使用异种抗原免疫序贯瘤内注射的方法 处理小鼠,观察肿瘤的大小,分离肿瘤浸润淋巴细胞,并利用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡及各细胞亚群的比例.结果 各组小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+ T细胞数量差异无显著性.免疫后治疗组中的CD3+ CD4+ T细胞、CD3+CD8+ T细胞以及CD3+ CD4+ CD25+ T细胞所占比例分别为54%、22%和2.91%,其中CD4+ 与CD8+ 的比值为2.49,与对照组比较差异有显著性(P＜0.01).结论 异种抗原序贯瘤内注射方法 可以增加肿瘤微环境中效应细胞的数量,减少CD3+ CD4+ CD25+ T调节细胞的表达,具有显著的抗肿瘤效应.
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中国版纳近交系小型猪心脏异种抗原表位α1,3-Gal的分布
目的研究中国版纳小型猪心脏的异种抗原α1,3-Gal的分布和半定量分析,为小型猪心脏的转基因和异种移植提供资料.方法通过亲和免疫组织化学法和图像分析对10头版纳小型猪心脏进行α1,3-Gal的分布和半定研究.结果α1,3-Gal主要分布于细胞膜,细胞浆也有少量表达,胞核无表达.在小型猪心内膜、心肌间质、心外膜、神经束膜等处有α1,3-Gal分布,心肌细胞未发现α1,3-Gal分布.半定量分析发现α1,3-Gal表达量心房内膜多,心肌间质少.结论异种抗原α1,3-Gal在心脏中的表达存在较大差异,提示可以通过转基因猪来克服超急性异种排斥反应.
