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敲除ADAR1抑制Notch1诱导小鼠T淋巴细胞白血病的发生
目的:探索ADAR1对于小鼠急性T淋巴细胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)发生发展的影响.方法:通过杂交繁殖获得Lck-Cre;ADAR1lox/lox小鼠及对照组ADAR11ox/lox小鼠;采用免疫磁珠法富集两组小鼠的lin-细胞,用携带MSCV-ICN1-IRES-GFP质粒的逆转录病毒分别感染上述lin-细胞,流式细胞术检测感染效率,分选并移植相同数量的GFP+细胞至受体小鼠中.在移植后持续观察并统计两组小鼠生存情况.结果:成功获得了T细胞特异敲除ADAR1的小鼠,并成功建立了Notch1诱导的小鼠T-ALL白血病模型.对照组小鼠在移植后发病,符合T-ALL特征;相反,ADAR1敲除组小鼠没有发生白血病.结论:ADAR1在Notch1诱导的T-ALL白血病的发生过程中起关键作用.
关键词： ADAR1 Notch1 急性T淋巴细胞白血病 条件性基因敲除 小鼠模型 -
软骨细胞条件性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型点突变小鼠的获得及其表型初步分析
目的 获得在软骨细胞中条件性敲除PIEN基因的FGFR3增强型点突变小鼠并进行初步表型分析.方法 通过FTEN条件性基因敲除小鼠(Ptenflox/flox小鼠),与软骨细胞特异表达Cre重组酶的小鼠(Col2aCre)交配,获得在软骨细胞中特异敲除PTEN基因小鼠(Col2aCre:Ptenfolox/flox);同时,利用Ptenflox/flox小鼠与FGFR3增强型点突变小鼠(Fgfr3G369C/+小鼠,即ACH小鼠)交配,子代杂合子小鼠(Ptenflax/:ACH)之间再交配,获得Ptenflox/flox:ACH小鼠;通过Col2aCre:Ptenflox/flox和Ptenflox/flox:ACH交配即可获得在软骨细胞中特异性敲除PTEN基因的FGFB3增强型点突变小鼠((Col2aCre:Ptenflox/flox:ACH).采用PCR对小鼠基冈型进行鉴定,免疫荧光染色检测PTEN基因的敲除效率,通过X光平片摄影对小鼠的表型进行初步分析.结果 获得了在软骨细胞中敲除PTEN的FGFR3点突变小鼠,免疫荧光染色证实Col2aCre:Ptenflox/flox:ACH小鼠软骨细胞中PTEN蛋白因为基因敲除而表达很低.初步的表型分析显示:Col2aCre:Ptenflox/flox:ACH小鼠身长、尾长均较Pten flox/flox:ACH小鼠长(P＜0.05,n=5).Col2aCre:Ptenflox/flox:ACH小鼠表型,较Ptenflox/flox:ACH小鼠的侏儒表型有所缓解.结论 采用基于Cre/LoxP系统的条件性基因敲除策略,获得了在软骨细胞中敲除PTEN基因的FGFR3增强型突变小鼠,表型分析初步显示,软骨细胞特异性敲除PTEN基因可部分缓解由FGFR3增强型点突变所导致的小鼠侏儒表型.该小鼠的获得,为研究P13K/AKT信号通路在FGFR3突变介导的软骨生长抑制中的作用提供了实验动物平台.
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LRP16肝特异性基因敲除小鼠模型的构建与鉴定
目的 建立白血病相关蛋白16(leukemia-related protein 16,LRP16)肝脏特异性基因敲除小鼠模型,进而在体内研究LRP16基因与胰岛素抵抗的关系.方法 构建LRP16基因重组载体,通过电转打靶转染胚胎干细胞(ES细胞),将筛选出的阳性ES细胞克隆,显微注射至超排小鼠的囊胚腔后移植于受体小鼠,从子代中筛选嵌合体小鼠,与野生型C57小鼠杂交后得到LRP16-Loxp转基因小鼠,再与Alb-Cre小鼠杂交后得到LRP16肝特异性基因敲除小鼠并进行鉴定.结果 得到8株阳性ES细胞克隆,经显微注射后得到2只雄性嵌合体小鼠,与野生小鼠杂交后得到1只LRP16-Loxp转基因小鼠,与Alb-Cre小鼠杂交后再自交筛选出2只小鼠经鉴定为LRP16肝特异性基因敲除小鼠.结论 成功建立LRP16肝特异性基因敲除小鼠模型,为研究LRP16基因与胰岛素抵抗的关系奠定基础.
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presenilin－1／presenilin－2双基因敲除小鼠的寿命观察
目的：观察Presenilin－1／Presenilin－2双基因敲除小鼠（ dKO mice）的生存曲线，为进一步繁殖及使用该模型对阿尔茨海默病（ AD）进行研究提供实验设计等提供参考。方法将dKO mice雌性50只，雄性30只，及野生型同系小鼠雌、雄各20只分为4组，观察正常喂养情况下4组间小鼠2年以内各自的生存情况及寿命，绘制生存曲线进行生存分析。结果 dKO mice随着时间的延长，雌、雄性生存概率分别低于野生型雌、雄性小鼠，差异均有统计学意义（P ＜0．001，P ＜0．001；P ＜0．001；P ＜0．001）；dKO mice雌、雄性之间的生存概率差异无统计学意义。结论条件性敲除presenilin－1与presenilin－2双基因可能会缩短小鼠的寿命，其生存概率显著低于野生型小鼠，而dKO mice雌、雄性之间的生存概率则无统计学差异。本实验结果可为借助此模型的实验设计应用提供有益参考。
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脑源性神经营养因子(rBDNF)转基因小鼠载体的构建和体外表达
目的 构建大鼠脑源性神经营养因子(rBDNF)的条件性转基因小鼠载体,鉴定其在体外细胞系中的表达.方法 用PCR方法扩增rBDNF片断,插入pNAO载体(lox-Stop-lox-IRES-EGFP),构建成rBDNF条件性基因载体(lox-Stop-lox-rBDNF-IRES-EGFP),使用Fugene 6转染试剂,将其同Cre重组酶表达质粒pGK-Cre共同导入HEK-293细胞系中,通过荧光显微镜观察、PCR 及ELISA方法确定Cre-lox同源重组. 结果 经酶切和测序鉴定,rBDNF条件性基因载体构建成功.共转染后的HEK-293细胞中,观察到绿色荧光蛋白(EGFP)的强荧光表达;细胞基因组DNA中检测到Cre-lox基因重组;对rBDNF定量检测的ELISA结果显示,细胞内有大量的rBDNF释放到细胞外. 结论 rBDNF条件性基因载体构建成功,在体外细胞系中,检测到rBDNF及EGFP强表达,为转基因显微注射打下基础.
关键词： 大鼠脑源性神经营养因子 条件性基因敲除 脑 增强绿色荧光蛋白 -
小鼠性激素结合球蛋白条件基因打靶载体的构建
目的：构建小鼠性激素结合球蛋白（Shbg）条件基因打靶载体。方法运用ET克隆的方法构建Shbg基因第4?7号外显子两侧插入loxp位点的条件性剔除载体。首先以BAC DNA为模板克隆出Shbg及其上、下游基因并打靶质粒载体（pBR322?MK?AB），利用该质粒和BAC克隆，通过同源重组方式，获得套取质粒（pBR322?Shbg?Re）；再分别以PL452及PL451为模板扩增出含Neo片段，经过再一轮的Red/ET重组成功实现条件性基因敲除打靶载体（pBR322?MK?SHBG?cko）的构建。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实，构建的pBR322?MK?AB、pBR322?Shbg?Re、SHBG?Ln重组质粒和Shbg条件基因打靶载体（pBR322?MK?SHBG?cko）结构正确，与设计相符。结论成功构建了小鼠Shbg条件基因打靶载体，为后续Shbg基因条件敲除小鼠模型的构建奠定了基础。
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Tex101条件性基因敲除小鼠模型的建立和表型鉴定
目的 建立Tex101 (Testis expressed gene 101)条件性基因敲除小鼠模型并进行表型鉴定.方法 构建针对小鼠Tex101基因2、3号外显子的重组载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞(ES细胞),用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定.利用显微注射把发生正确同源重组的ES细胞注射进C57BL/6J小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫.将得到的嵌合体小鼠与C57BL/6J雌鼠交配获得Tex101-LoxP转基因小鼠.该小鼠与EⅡa-Cre转基因小鼠杂交,通过子代自交获得Tex101条件性基因敲除(cKO)小鼠并进行初步分析.结果 得到2只Tex101 cKO雄鼠.冰冻切片观察发现Tex101 cKO雄鼠睾丸形态和大小与野生型小鼠相比无明显差异.结论 成功建立了 Tex101条件性基因敲除小鼠模型,并初步验证了该基因对雄性小鼠睾丸大小和形态无明显影响,为进一步研究Tex101基因功能奠定了基础.
关键词： Tex101 条件性基因敲除 胚胎干细胞 EⅡa-Cre转基因小鼠 -
HIF-1α对颏舌肌发育和肌纤维类型的影响
目的 研究低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)对骨骼肌发育及肌纤维分型的影响.方法 将HIFflox/-转基因小鼠和骨骼肌环化重组酶(muscle creatine kinase-cyclization recombination enzyme,MCK-Cre)转基因小鼠交配,子代中获得HIFflox/-Cre+小鼠互交,得到骨骼肌HIF-1α条件性敲降的HIFflox/flox Cre+基因型小鼠(C57BL/6J),取新生小鼠尾尖与骨骼肌组织鉴定基因型及敲降效率.随机选取HIF-1α敲降小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)各10只,取颏舌肌组织总RNA,使用荧光定量PCR检测4种肌纤维类型(Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx)在不同基因型小鼠骨骼肌中的表达差异.结果 HIF-1 α在基因敲除小鼠(KO)的骨骼肌中的表达量较野生型小鼠(WT)有明显降低(P＜0.05).相对于野生型小鼠(WT),基因敲除小鼠(KO)颏舌肌的Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx型肌纤维表达量有降低趋势,而Ⅱb型纤维表达量有升高趋势.结论 Cre-loxP系统成功构建骨骼肌特异性敲除HIF-1α的转基因小鼠模型.HIF-1α在成肌分化过程中能够促进肌纤维Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx分化,抑制Ⅱb纤维分化.
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单核细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ条件敲除小鼠的繁殖和基因型鉴定
目的 构建和鉴定单核细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)条件性基因敲除小鼠.方法 将引进的纯合子PPARγ-loxp小鼠和单核细胞特异性表达cre重组酶的Cx3crlcre小鼠进行杂交,得到F1代,用RT-PCR方法鉴定其基因型.将F1代进行自交产生F2代,鉴定基因型,筛选实验所需的PPARγ条件性基因敲除小鼠(实验组,PPARγ-ko)及对照组小鼠(对照组,PPARγ-wt),利用免疫荧光及Western blotting方法鉴定敲除效果.结果 筛选出基因型为PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-和PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/cre的小鼠即为本实验所要构建的单核细胞PPARγ条件基因敲除小鼠,基因型为PPARγ loxp/loxp Cx3cr1-/-小鼠为实验对照组小鼠.结论 成功获得单核细胞PPARγ条件性基因敲除小鼠,为单核细胞上PPARγ功能的研究提供小鼠模型.
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转录因子GATA4对颅面骨发育与矿化的影响
目的:通过条件性基因敲除小鼠模型,探讨转录因子GATA4在颅面骨发育与矿化中的作用.方法通过Cre-loxp转基因小鼠技术,将Wnt1-Cre转基因小鼠与GATA4fl/fl转基因小鼠杂交,得到神经嵴细胞特异性GATA4基因敲除小鼠(Wnt1-Cre;GATA4fl/fl).取2周龄雄性GATA4条件敲除小鼠和野生型小鼠各5只处死后应用Micro-CT进行颅盖骨、腭骨和右侧下颌骨的骨形态及骨密度分析.结果:与野生型小鼠相比,GATA4条件敲除小鼠的颅盖骨长度、宽度、鼻额角、腭部宽度、下颌骨长度及高度均明显减小,而腭中缝宽度增大(P<0.05).下颌骨骨小梁体积分数、骨小梁数量均下降,骨小梁间隔增加(P<0.05).结论 :GATA4参与调控了颅面部骨的发育,对颅面部骨的形成和矿化具有重要调控作用.
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条件性敲除Osterix基因获得先天性脊柱侧凸小鼠动物模型及表型分析
目的 通过Osterix基因敲除获得先天性脊柱侧凸动物模型及表型分析.方法 应用Cre-LoxP系统繁育成骨细胞特异性敲除Osterix基因小鼠.取4、12周龄的敲除小鼠各10只,以同龄同系野生型小鼠各10只为对照,行全身及脊柱X线摄像观察；收集脊柱标本行苏木素-伊红(HE)染色及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察并检测.结果 成功获得成骨细胞特异性敲除Osterix基因小鼠,X线显示敲除小鼠中75％出现严重的脊柱侧凸,Cobb角平均值为35..HE染色显示敲除小鼠椎体生长板增宽,椎体骨量增加,TRAP染色显示腰椎中破骨细胞数量显著减少(P＜0.05).结论 小鼠成骨细胞中条件性敲除Osterix基因后成功获得先天性脊柱侧凸模型,提示Osterix在先天性脊柱侧凸的发病中有重要作用.
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选择性敲除小鼠神经细胞 Adam10基因导致大脑皮质发育不良
目的：研究 Adam10基因在小鼠神经系统发育中的作用。方法：利用 Cre-loxp 转基因鼠技术，将 Gfapcre转基因鼠和 Adam10lox/lox 转基因鼠杂交，得到神经细胞特异性 Adam10基因敲除鼠（Gfapcre-Adam10lox/lox），在出生后第14天对大脑切片行 HE 染色，观察 Adam10基因敲除后神经系统发育情况。结果：选择性敲除小鼠神经细胞 Adam10基因（Gfapcre-Adam10lox/lox），小鼠可存活至出生后3周左右，部份小鼠大脑皮质单侧或双侧缺失，未出现皮质缺失的小鼠大脑皮质经 HE 染色提示出现层次结构紊乱。结论：Adam10基因在小鼠神经系统发育中具有重要作用，选择性敲除神经细胞 Adam10基因后导致小鼠大脑皮质缺失或层次结构紊乱。
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成年新生神经元NMDA受体NR2B亚型基因条件性敲除模型建立
目的:建立成年神经发生中新生颗粒细胞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚型基因条件性敲除模型.方法:运用逆转录病毒基因标记技术,结合Cre-loxp重组酶系统,在ROSA26-LacZ基因报告小鼠体内研究逆转录病毒RSV-pGFP:T2aCre的Cre酶重组的发生以及其转化效率.在NR2Bf1/f1转基因小鼠中建立成年新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型.结果:在逆转录病毒注射后14 d,观察到LacZ标记的神经元及β-gal和Cre免疫荧光双标阳性细胞,在海马齿状回颗粒下层、颗粒层以及hilus区表达;同时在嗅球颗粒层也可见Lacz表达.28 dCre转化效率高达98.3%.在NR2Bf1/f1转基因小鼠,14 d时分别在嗅球和齿状回的颗粒细胞层,观察到GFP和Cre同时标记的阳性新生颗粒细胞.结论:成年神经发生中起源于海马齿状回颗粒下层和侧脑室旁脑室管膜下区的新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型建立.
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mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠模型的构建与鉴定
目的:为研究支架蛋白JLP在肾脏中的生理功能,建立小鼠精子相关抗原(mSpag9)肾脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究该基因所发挥的重要生理功能提供材料和思路.方法:构建mSpag9基因重组载体,通过电转打靶转染胚胎干细胞(ES细胞),将筛选出的阳性ES细胞克隆,经显微注射至超排小鼠的囊胚腔后移植于受体小鼠,从子代筛选嵌合体小鼠,与携带flp位点C57/BL6N小鼠杂交后得到mSpag9flox/+基因敲除小鼠,自交筛选出mSpag9flox/flox小鼠,再与KSP-CreERT2小鼠杂交得到mSpag9flox/flox-Cre肾脏特异性基因敲除小鼠并进行鉴定,待小鼠成长至5周,使用Tamoxifen(10 mg/mL葵花籽油溶解)腹腔注射(0.04 mg/g)诱导Cre重组酶特异性表达于肾小管上皮细胞.结果:经PCR扫描后得到10株阳性ES细胞克隆,其中6株使用Southern Blot鉴定;经显微注射后得到4只雄性、5只雌性嵌合体小鼠,与flp小鼠杂交后得到9只mSpag9flox/+基因敲除小鼠,将自交得到的mSpag9flox/flox小鼠与KSP-CreERT2小鼠交配筛选出mSpag9flox/+-Cre+3只小鼠,将其与mSpag9flox/flox小鼠回交得到基因型为mSpag9flox/flox-Cre+小鼠,即为mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠.结论:该模型利用Cre-Loxp系统实现基因mSpag9的基因打靶,Tamxifen诱导基因mSpag9实现该基因在肾小管上皮细胞上敲除,为进一步研究mSpag9基因及支架蛋白在肾脏生理病理进展中所发挥的作用提供工具.
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血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠与非基因敲除小鼠在急性肺损伤肺组织病理改变以及肺微血管通透性变化的比较
目的 比较血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠与非基因敲除小鼠在急性肺损伤肺组织病理改变和肺微血管通透性变化的差异.方法 cdc42flox/flox小鼠与血管内皮细胞特异性表达cre重组酶的小鼠杂交,取其基因型为cde42flox/+Cre+/-的子代小鼠与cdc42flox/flox小鼠回交,得到基因型分别为Cdc420flox/+Cre+/-、Cdc42flox/+Cre-/-、Cdc42flox/floxCre-/-的小鼠,其中Cdc42flox/+Cre+/-为血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠,其余两种同一窝出生的非基因敲除小鼠作为对照组,在各组小鼠气道内滴入LPS,制成急性肺损伤模型,比较各组小鼠在肺组织病理改变、病理评分、肺湿干重比值、肺微血管通透系数等指标变化的差异.结果 血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠急性肺损伤模型在肺组织病理改变、病理评分、肺湿干重比值、肺微血管通透系数等方面与对照组小鼠比较无明显统计学差异.结论 血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因杂合子小鼠与非基因敲除小鼠比较,在急性肺损伤中肺组织病理改变和肺微血管通透性的变化无明显差异.
关键词： 条件性基因敲除 Cre/loxp技术 CDC42基因 急性肺损伤 血管通透性 -
成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1小鼠的制备
目的 制备在成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1的特定细胞阶段性基因敲除小鼠.方法 从美国NIH引进SPF级fgfr1条件性基因敲除(fgfr1flox/flox)小鼠,进行饲养、繁殖和PCR鉴定;fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达Cre重组酶的OC-Cre小鼠交配,获得在成熟成骨细胞中敲除一个基因拷贝的杂合子小鼠;杂合子小鼠之间交配,或者杂合子小鼠与fgfr1flox/flox小鼠交配,可以获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1基因的小鼠fgfr1△/△/OC-CreTG/+.结果 成功制备在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的细胞特异性敲除小鼠.结论 成功引进fgfr1flox/flox小鼠,应用合理的基因条件性敲除繁殖策略,获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的基因敲除小鼠.
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HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠的获得
目的 应用Cre/loxP系统建立HIF-1α条件性基因敲除小鼠模型.方法 电击法将构建好的HIF-1α条件性基因敲除载体转染入小鼠ES细胞,用G418与Ganciclovir对转染的ES细胞进行正负筛选,经Southern杂交鉴定得到阳性ES细胞克隆后,将已发生正确重组的ES细胞显微注射入小鼠囊胚腔,对子代鼠进行基因型鉴定.结果 经G418与Ganciclovir筛选培养得到490个阳性克隆,用5'端探针进行Southern杂交鉴定获得1株发生同源重组的ES细胞克隆,经显微注射,得到5只由基因敲除ES细胞和供体囊胚细胞共同发育而来的嵌合体小鼠.结论 成功得到基于Cre/loxP系统的HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠模型.
关键词： 低氧诱导因子-1α 条件性基因敲除 同源重组 胚胎干细胞 Cre/Loxp系统 -
低氧诱导因子-1α条件性敲除载体的构建
目的通过建立低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)条件性敲除载体,并在体外验证引入的LoxP介导的同源重组等情况,为终建立HIF-1α条件性敲除小鼠模型奠定基础.方法以含有neo、tk基因的pLoxPneo载体为基本骨架,用涵盖3、4、5、6号外显子的HIF-1α基因组片段(7.6kb)为构建载体的同源DNA片段,通过引入LoxP等步骤,终建立旨在条件性敲除HIF-1α第5号外显子的条件性敲除载体.结果经酶切,测序和在体外细菌中用cre介导的重组等方法证明成功地构建了HIF-1α的条件性敲除载体.结论成功地构建了HIF-1α的条件性敲除载体,为今后进一步获得HIF-1α条件性敲除小鼠打下了基础.
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小鼠Pkd2基因条件性敲除打靶载体的构建
[目的]构建小鼠Pkd2条件性基因敲除打靶载体,为建立Pkd2基因条件性敲除小鼠模型奠定基础.[方法]以正常小鼠(129×1/SvJ)基因组DNA为模板,扩增小鼠Pkd2基因一段包括第9号外显子的长为9.3kb的序列,通过引入LoxP和Neo基因等步骤,建立条件性敲除Pkd2第9号外显子的条件性基因打靶载体.[结果]经多个限制性核酸酶酶切鉴定和测序证实,所构建的Pkd2基因条件性敲除打靶载体符合设计要求.[结论]成功构建小鼠条件性Pkd2基因敲除打靶载体,为建立Pkd2基因条件性敲除小鼠模型奠定基础.
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敲除小鼠生殖细胞Wdr1基因对卵巢功能的影响
目的 探讨敲除小鼠Wdr1基因对其卵巢功能的影响.方法 用条件性基因敲除小鼠Wdr1 fl/fl和生殖细胞特异性启动子驱动的Cre重组酶转基因小鼠构建卵母细胞特异性基因敲除小鼠模型.取出生14天、28天和4个月3个时间点的Wdr1 fl/-;Ddx4-Cre小鼠与对照鼠(每个时间点每种1只),处死.取卵巢,拍照、石蜡连续切片及苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)处理,观察卵巢体积变化及各级卵泡的数量.结果 14天Wdr1 fl/-;Ddx4-Cre小鼠卵巢体积比对照小鼠略小;HE切片镜下可见原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡等,较对照鼠略少.28天及4个月Wdr1 fl/-;Ddx4-Cre小鼠卵巢体积明显小于对照小鼠;HE切片镜下可见各级卵泡明显少于对照小鼠.结论 敲除小鼠生殖细胞Wdr1基因对其早期卵巢功能略有影响,随着时间的推移,可导致卵巢早衰.
