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全骨髓贴壁法培养人骨髓间充质干细胞的改良研究
本研究旨在利用红细胞自然沉降性原理,以传统的全骨髓贴壁法为基础,探讨一种改良后简便而高效的人骨髓间充质干细胞培养方法.采用6孔板培养细胞,将骨髓标本用MSC完全培养液培养48 h,吸取上层无红细胞的上清层,置于新的培养孔以分离获取MSC.用倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况,记录细胞首次贴壁时间、首次传代时间,并以传统全骨髓贴壁法为对照;应用流式细胞术检测细胞周期、细胞表面标记;用油红O及碱性磷酸酶试剂盒分别对MSC成脂、成骨能力进行鉴定;应用计数板计数法描绘第1代,第3代,第5代MSC增殖曲线.结果表明,用改良法培养的MSC高表达CD90、CD105、CD13、CD44,低表达CD14、CD45、CD34;细胞周期中G0/G1期88.76％,G2/M期3.04％,S期8.2％,符合干细胞周期特征;增殖曲线呈典型“S”型;油红O与碱性磷酸酶染色均为阳性.同时与传统方法相比,改良方法的细胞贴壁率显著高于传统方法(P =0.0004),首次贴壁时间短(P＜0.0001)、首次传代时间短(P =0.001).结论:骨髓标本培养48 h后的上清层中含大量贴壁活性的悬浮MSC,改良方法是一种比传统贴壁法更具有便捷、高效等优点的培养方法.
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改良全骨髓贴壁法分离与纯化大鼠骨髓间充质干细胞
目的探讨有效的分离与纯化大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）方案，并研究BMSCs基本生物学特性。方法取SPF级4周龄健康SD大鼠1只，采用改良全骨髓贴壁法分离提取BMSCs，用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及其生长特性，利用流式细胞仪检测P3代细胞表面标志物，细胞计数试剂盒（CCK）-8法绘制P3代细胞生长曲线。结果体外分离的原代细胞可见典型的贴壁生长，形态以梭形和多角形为主，呈旋涡状细胞集落，约8 d可达80%以上融合。传代纯化后细胞形态均一，具有较强的增殖能力。生长曲线提示BMSCs呈S形趋势。P3代 BMSCs代表面标志物分化群（CD）29、CD90阳性表达，而CD11b、CD45阴性表达。结论改良全骨髓贴壁法可获得高纯度、增殖活跃、生物学特性稳定的BMSCs，BMSCs的生长曲线呈S形趋势。
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大鼠骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定
目的：探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）方法以及通过形态学观察BMSCs在培养过程中是否存在自分化现象。方法应用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs ，倒置显微镜下观察细胞形态，直接荧光抗体染色法鉴定培养的细胞，免疫细胞化学方法鉴定其向神经元的诱导分化。结果原代末期及传代的BMSCs呈均一长梭形生长，第三代荧光抗体染色CD29，CD90阳性表达，神经元特异性标记物Nse（神经元特异性烯醇化酶）表达阳性，BMSCs在未加任何诱导剂时培养30d时发生了自分化现象。结论贴壁培养法是一种有效的获得高纯度BMSCs的方法，在体外培养时BMSCs可发生自分化现象。
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应用全骨髓贴壁法获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究
目的 探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并测定其生长曲线,流式细胞术检测细胞周期,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志CD34、CD44及CD45.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.细胞生长曲线示,在传代后的第4-5天细胞开始明显增殖,进入指数增生期.细胞周期显示81.49%P3代细胞为G0/C1期,经免疫细胞化学染色结果显示CD44阳性,CD34、CD45阴性.结论 体外应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,而且此法简单易行、经济.
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骨髓间充质干细胞的成骨性诱导
目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的效果.方法:采用全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,把生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为两组,对照组用DMEM-LG培养基培养;实验组用含有成骨诱导剂的DMEM-LG培养基培养.结果:全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞贴壁且呈梭形;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组(P＜0.01),茜素红染色出现阳性的钙化结节.结论:全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性.
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间充质干细胞分离方法的研究与进展
背景：间充质干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程和临床治疗，而安全、高效的分选方法是间充质干细胞建系的前提。
目的：综述近年来间充质干细胞分选方法的研究进展，比较各方法的优缺点，为安全、高效分离间充质干细胞提供理论依据。
方法：第一作者检索 CNKI 数据库(http：//epub.cnki.net/)和 PubMed 数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)的相关文献。中文检索词为“间充质干细胞、分离方法”；英文检索词为“mesenchymal stem cel s (mscs)，isolation methods”。查阅1965至2014年来间充质干细胞分离方法的相关文献，包括综述、临床研究和基础研究，终纳入52篇文献。
结果与结论：①全骨髓贴壁法可快速获得大量间充质干细胞，但需要进一步纯化。②梯度密度离心法选择密度为1.073 g/mL的介质在原代能得到相对较纯的间充质干细胞。③组织消化法适用于脂肪、脐带等组织进行消化分离，选用胶原酶Ⅱ消化效果更佳，但是均存在操作技术要求高的缺陷。④免疫磁珠法适用于研究表达特定细胞表面标记物的某一个间充质干细胞亚群的生物学特性。⑤各种分离方法相结合也是一种理想选择。⑥对于近年来出现的分离新方法，由于案例有限，其可靠性有待进一步研究。 -
妇科养坤丸与骨髓间充质干细胞移植修复薄型子宫内膜
背景：已有研究发现骨髓抑制后女性患者的子宫内膜中检测到来源骨髓供体的内膜细胞。目的：探讨妇科养坤丸对骨髓间充质干细胞治疗薄型子宫内膜的促进作用。方法：取处于动情期的雌性大鼠30只随机分为正常对照组、模型组、单药组、骨髓间充质干细胞组、联合组，每组6只，除正常对照组外，其余各组大鼠建立薄型子宫内膜模型。正常对照组正常喂食，模型组尾静脉注射生理盐水，骨髓间充质干细胞组造模后6 h和10 d经尾静脉注射异体骨髓间充质干细胞1 mL，单药组造模后连续20 d灌胃妇科养坤丸水溶液5 mL/kg，联合组造模后6 h和10 d尾静脉注射骨髓间充质干细胞1 mL以及连续20 d灌胃妇科养坤丸水溶液10 mL/kg。造模后第21天苏木精-伊红染色观察子宫内膜组织形态变化，测量子宫内膜厚度，免疫印迹法检测子宫内膜角蛋白与波形蛋白的表达。结果与结论：①与模型组相比，骨髓间充质干细胞组、单药组和联合组的子宫内膜均有不同程度增厚，其中联合组接近正常对照组。②正常对照组的角蛋白和波形蛋白表达强，模型组的表达低，单药组、骨髓间充质干细胞组和联合组依次升高(P <0.05)。③结果表明骨髓间充质干细胞移植于薄型子宫内膜大鼠体内可修复子宫内膜组织，妇科养坤丸能够显著促进骨髓间充质干细胞对子宫内膜的修复作用。
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建立ICR小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定方法
目的:建立一种简单的高效分离、培养、纯化和鉴定ICR小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,初步研究其相关生物学特性.方法:全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,用倒置显微镜观察细胞的形态和生长情况;用流式细胞仪鉴定细胞表面标记物;诱导细胞定向分化为成脂细胞、成骨细胞,以检测细胞多向诱导分化能力.结果:利用该方法纯化的BMSCs形态均一,多为梭形.第3代BMSCs进行流式检测CD29、CD44均呈阳性表达,表达率分别为97％、90％;CD34、CD45呈阴性表达;且能够成功诱导分化成成骨细胞、成脂细胞.结论:利用全骨髓贴壁法可以高效分离、纯化ICR小鼠的BMSCs,生物学特性稳定.
关键词： 骨髓间充质干细胞(BMSCs) ICR小鼠 全骨髓贴壁法 -
SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离及5-氮胞苷对其的诱导分化作用
目的：探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞（SD- MSCs）体外分离的方法条件、生物学特性及5-氮胞苷对其的诱导分化作用。方法采用全骨髓贴壁法分离培养SD- MSCs，进行形态学观察，绘制生长曲线，流式细胞仪对其细胞周期进行分析，并通过成脂肪诱导鉴定，给予5-氮胞苷进行诱导分化，通过免疫组化和蛋白免疫印迹法,观察其对超极化激活环核苷酸门控的通道蛋白(HCN2）表达情况。结果 SD- MSCs以长梭形和多角形为主，呈放射状集落生长，细胞生长曲线呈S形，增殖能力比较活跃。成脂肪诱导后，细胞胞质内有大量橙红色脂滴形成。不同浓度的5-氮胞苷对SD- MSCs进行诱导分化后，7.5、10、12.5μmol/L5-氮胞苷诱导的HCN2表达阳性强度较高，其中10μmol/L的5-氮胞苷诱导24h的SD- MSCs HCN2表达强度高。结论全骨髓贴壁法能够有效分离纯化增殖SD- MSCs，5-氮胞苷能够诱导其分化为HCN2表达阳性的细胞。
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双合汤含药血清促进BMSCs体外增殖的研究
目的 观察双合汤含药血清对SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外增殖的影响. 方法 采用全骨髓贴壁方法提取BMSCs,显微镜观察形态,流式细胞仪检测其表面标记物,计数法绘制其生长曲线,分别用低剂量、中剂量、高剂量10％双合汤含药血清代替胎牛血清(FBS)进行药物干预. 结果 培养的细胞以梭形为主,呈漩涡状生长;流式细胞仪检测CD34阳性率为0.96％,CD90阳性率为93.51％;生长曲线似倒S型;给药组的BMSCs增值速度比空白对照组均快,其中高剂量组增值速度快. 结论 双合汤含药血清能促进BMSCs体外的增值速度,且高剂量双合汤含药血清促进BMSCs的增值速度为明显.
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罗曼鹤鸡骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定
目的 建立鸡骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养和鉴定体系.方法 从1～ 14天龄罗曼鹤鸡骨髓中分离骨髓细胞,差速贴壁法纯化、扩增BMSCs.倒置显微镜下观察细胞形态特征,MTT法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞标志物,并分别进行成骨、成脂诱导分化能力检测.结果 分离培养的细胞呈成纤维细胞样或长梭形,生长状态良好;CD29阳性表达率为92.10％,CD34阳性表达率仅为0.80％;经成骨诱导分化,出现明显的钙化结节,茜素红染色阳性;经成脂诱导分化,油红O染色阳性,细胞内出现明显的脂质小滴.结论 建立了操作简单、高效的鸡BMSCs分离培养和鉴定体系,为鸡BMSCs的进一步研究和应用提供了良好的基础.
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全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞
目的：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），并进行成骨、脂肪细胞诱导分化及鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs ，倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况；分别绘制BM-SCs的生长曲线及贴壁率曲线，检测细胞活性；诱导细胞向脂肪及成骨细胞方向分化，检测细胞的多向分化潜能。结果分离培养的原代BMSCs 24 h出现贴壁现象，6 d后出现明显的集落生长，传代后细胞呈长梭形，形态均一，纯度高。 P3代细胞培养2 h贴壁30％以上，4 h贴壁60％，8 h贴壁70％以上，12 h贴壁90％。细胞生长曲线呈S形，显示细胞分别在第2、3、8天进入潜伏期、对数期、平台期。加入成骨及脂肪细胞诱导剂后，细胞碱性磷酸酶及油红O染色均阳性，表现出成骨及脂肪细胞的生物学特征。结论全骨髓贴壁法分离培养获得的细胞纯度较高，活性较强，增殖快，且具有BMSCs的一般生物学特性，此方法可以作为组织工程获取BMSCs的一种常用方法。
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大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定
目的 体外分离、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(MSC).方法 全骨髓贴壁法体外分离、培养3月龄SD大鼠MSC,利用差速贴壁原理纯化MSC,并通过形态学观察、细胞表面抗原标志物、多细胞系诱导分化对其进行鉴定.结果 P3代不表达抗原CD34和CD45,表达抗原CD29和CD44,符合MSC表面标志物特征.P3代MSC定向诱导后经ALP染色、矿化结节染色、油红O染色、Ⅱ型胶原荧光染色后鉴定具有骨向分化、脂向分化及软骨分化能力.结论 全骨髓贴壁法能够建立稳定的MSC体外分离培养体系.
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全骨髓贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞及成骨诱导分化
[目的]:探讨体外分离骨髓间充质干细胞的方法及其成骨潜能.[方法]:应用全骨髓贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型,碱性磷酸酶及茜素红染色检测成骨能力.[结果]:传代后的人骨髓间充质干细胞形态均一呈成纤维细胞样.第三代骨髓间充质干细胞免疫表型CD90、CD13、CD105、CD44阳性,CD34、CD45、CD14阴性.96.47％细胞处于G0/G1期,14 d、21 d成骨诱导培养后碱性磷酸酶及茜素红染色阳性.[结论]:应用全骨髓贴壁法体外分离培养人骨髓间充质干细胞简便、经济、高效.
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全骨髓贴壁法获取组织工程髓核种子细胞的相关研究
目的 明确兔骨髓间充质干细胞的分化能力及分化条件,以TGF-β3和BMP-7诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,为组织工程髓核的构建提供良好的种子细胞.方法 利用全骨髓贴壁法分离获取兔骨髓间充质干细胞,并对细胞进行培养和传代,以特定的环境及细胞诱导液进行诱导,促使其向特定的中胚层细胞分化.再将细胞分为四组,A:空白对照组,B:BMP-7诱导组,C:TGF-β3诱导组,D:TGF-p3与BMP-7共同诱导组,诱导21天后对蛋白聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9基因进行realtime-PCR检测.结果 全骨髓贴壁法分离获得的原代兔骨髓间充质干细胞生长良好,2周后显微镜下观察细胞间形态较为一致,成纺锤形.细胞传代后生长良好.细胞表面表达CD29、CD105、CD166表面标记物.在成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和脂肪诱导培养液的诱导下,培养21天后,通过特定染色发现兔骨髓间充质干细胞向预定方向分化生长.以TGF-β3和BMP-7生长因子诱导21天后,蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和SOX9基因表达C组和D组明显高于A组和B组(P＜0.05),Ⅹ型胶原表达A组和B组明显高于C组和D组(P＜0.05),Ⅰ型胶原表达四组之间无明显差异.结论 全骨髓贴壁法可以成功分离获得状态良好的兔骨髓间充质干细胞,在成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和脂肪诱导培养液的诱导下,兔骨髓间充质干细胞可向预定的方向分化且生长良好.TGF-β3和BMP-7诱导兔骨髓间充质干细胞后可明显提高其类髓核细胞具有的下游基因表达水平.
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骨髓间充质干细胞对染矽尘小鼠肺部早期炎症抑制作用
目的：研究骨髓间充质干细胞（ BMSCs）移植对染矽尘小鼠肺部早期炎症的影响。方法取5只无特定病原体级健康雄性C57BL／6小鼠，采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs。取30只同类小鼠随机分为对照组、二氧化硅组和BMSCs移植组3组，以气管暴露法建立动物模型，对照组小鼠予气管内一次性注射0．90％氯化钠溶液20．0μL；二氧化硅组和BMSCs移植组小鼠先予气管内一次性注射20．0μL质量浓度为250 g／L的二氧化硅混悬液，6 h后再分别经尾静脉输注500．0μL的0．90％氯化钠溶液或细胞密度为1×109／L的BMSCs悬液。造模后第7天处死小鼠，观察肺组织病理学改变情况，采用酶联免疫吸附实验检测小鼠血清中白细胞介素（ IL）－1β、IL－6和IL－10水平，采用实时定量聚合酶链反应仪检测小鼠肺组织中上述细胞因子mRNA的表达情况。结果 BMSCs表面分子分化抗原（CD）29、CD34、CD90、CD105、CD106的阳性率分别为67．70％、0．12％、39．00％、37．10％和20．10％。肺组织病理学观察显示，二氧化硅组小鼠肺泡壁增厚，肺泡间隔增宽，肺泡结构破坏；BMSCs移植组肺组织结构无明显破坏，肺泡腔大小均匀，肺泡结构完整。二氧化硅组小鼠血清中IL－1β、IL－6水平以及肺组织中IL－1β、IL－6 mRNA相对表达水平分别高于对照组和BMSCs 移植组（ P＜0．05）， BMSCs移植组小鼠血清中IL－1β水平和肺组织中IL－1βmRNA相对表达水平均高于对照组（ P＜0．05）。各组小鼠血清中IL－10水平和肺组织中IL－10 mRNA相对表达水平分别比较，差异均无统计学意义（ P＞0．05）。结论 BMSCs可通过下调促炎因子IL－1β和IL－6的表达减轻染矽尘小鼠肺部早期炎性损伤。
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全骨髓贴壁法与密度梯度离心法培养小鼠内皮祖细胞的方法比较
目的:比较全骨髓贴壁法与密度梯度离心法分离培养小鼠内皮祖细胞(EPCs)的差异.方法:取8周龄雄性近交系昆明小鼠,提取原代EPCs,分别采用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法分离培养细胞,观察细胞形态、细胞摄取DiI-acLDL、结合FITC-UEA-I双阳性率及细胞生长增殖情况.结果:全骨髓贴壁法培养第4天,可见较多贴壁细胞,呈圆形、短梭形,部分为长梭形;第6～8天贴壁细胞多为梭形及类圆形;随着培养时间的延长,梭形细胞数量渐渐增多,可出现细胞集落,10d后EPCs大量增殖,14d细胞长满培养瓶底部.密度梯度离心法接种24 h后可见圆形贴壁细胞,并逐渐增多变形;培养至第4～7天,可以观察到贴壁细胞明显增多且体积变大,细胞为类圆形、梭形或多边形,第7～9天,细胞呈集落生长,多数细胞呈多边形或长梭型;培养至第2周可见贴壁细胞生长呈“铺路石”样外观.全骨髓贴壁法细胞摄取DiI-acLDL和结合FITC-UEA-I双阳性率高于密度梯度离心法(P＜0.05),但两种方法细胞增殖率比较无明显差异(P＞0.05).结论:全骨髓贴壁法与密度梯度离心法均可培养出EPCs,且两种方法培养的细胞增殖活性相当,但前者更简单易行,EPCs培养成功率更高.
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兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定
目的:观察兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础.方法:应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定.经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Vankossa银染染色及碱性磷酸酶染色.结果:经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa 银染均可观察到矿化结节.碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组强强阳性.结论:全骨髓贴壁法是分离培养兔BMSCs简便可行的方法.BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞.
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体外全骨髓贴壁法培养人骨髓间充质干细胞的实验研究
目的：探讨体外采用全骨髓贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞（human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs）的可行性，为研究hBMSCs提供实验细胞来源。方法从因创伤导致骨折需行骨折复位及髂骨植骨术的志愿者中，获取骨髓，采用全骨髓贴壁法培养和分离hBMSCs，在倒置相差显微镜下观察细胞生长形态，取P3代细胞行表型鉴定；取P1、P2、P3代细胞，分别用胰蛋白酶消化，以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，绘制hBMSCs生长曲线图。结果经全骨髓贴壁法培养分离获得了纯度较高的hBMSCs，细胞呈均一的长梭形、短梭形及多角形，漩涡状或辐射状结构，绘制的生长曲线呈S形。P3代hBMSCs经流式细胞鉴定：CD29、CD44、CD90、CD105分别为99.6%、100%、99.4%、92.5%，呈阳性表达；而表达CD34、CD45分别为0.5%、0.6%，呈阴性表达。结论体外应用全骨髓贴壁培养法可成功分离hBMSCs，方法操作简单易行、经济，且能大限度的保持细胞活力。
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兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定
目的:探讨一种简便可行的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法.方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线；倒置相差显微镜观察细胞形态；并向软骨细胞诱导分化,采用番红快绿染色和甲苯胺蓝染色鉴定.结果:经全骨髓贴壁法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长；成软骨诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出软骨细胞的形态特征和生物学特征.结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养兔骨髓间充质干细胞的理想方案,在适当的条件下BMSCs能多向分化.
