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增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展
CpG 基序(CpG motifs)是指含有非甲基化的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)核苷酸核心的寡聚脱氧核苷酸(ODN)序列,又称为免疫刺激序列,一般为 6 个寡聚核苷酸.1995年,Krieg 等[1]研究发现非甲基化的 CpG 二寡聚核苷酸是病原体 DNA 免疫刺激活性的结构基础,自此,对 CpG 基序的各种研究得以展开,包括 CpG 基序免疫刺激机制、CpG 基序个数及结构对免疫刺激活性影响、CpG 寡聚脱氧核苷酸作为佐剂使用等.
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结核分支杆菌基因组DNA指纹技术在结核病流行病学中的应用
结核分支杆菌基因组DNA指纹技术，可以在种、株水平对结核分支杆菌进行鉴定，因此在结核病学的多个领域，尤其是流行病学中有很大的应用价值。 一、结核分支杆菌基因组DNA指纹技术及标准方法的确立 将结核分支杆菌的基因组DNA采用特殊的技术切割成大小不同的片段，电泳分离，就可以清楚地看到像人的皮肤指纹一样具有特征性的条带。这就是结核分支杆菌的DNA指纹。建立结核分支杆菌DNA指纹的主要技术有：限制性片段长度多态性(RFLP)方法和聚合酶链反应（PCR）方法。RFLP方法为：针对结核分支杆菌基因组DNA上的特征片段，如插入序列IS6110［1］、IS1081［2］，多态性富含GC重复序列［3］，（GTG）5寡聚脱氧核苷酸［4］等，利用限制性内切酶酶切特征性片段上的某一位点，电泳分离、Southern blot而形成结核分支杆菌DNA指纹图谱。该方法具有良好的特异性和稳定性，已成为结核分支杆菌株水平鉴定的主要方法［5，6］。PCR方法为：针对结核分支杆菌基因组DNA上的特征片段，如IS6110、DR［7］、16S rDNA［8］，设计特异的引物进行多种方式的聚合酶链反应，电泳分离，而形成结核分支杆菌DNA指纹图谱。该方法简单快速，但特异性和稳定性不及RFLP方法，目前作为RFLP方法的补充。
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bcl-2部分编码区的反义RNA促进烷化溶血磷脂诱导的白血病细胞凋亡
bcl-2抗凋亡基因在白血病细胞株常有高表达,引起对化放疗的耐受,封闭该基因的转录和翻译都将诱导白血病细胞凋亡,且对化放疗敏感.本研究通过比较逆转录病毒载体介导的全部和部分编码区的bcl-2反义基因瞬时和稳定表达在对抗bcl-2作用、降低内源性bcl-2蛋白水平和对烷化溶血磷脂ET 18-OCH3 (ALP)诱导白血病细胞凋亡的影响的差异,探讨了短片段bcl-2反义RNA作用特点,以期为硫代寡聚脱氧核苷酸的治疗白血病和对ALP协同体外净化白血病细胞提供实验基础.
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核转录因子-圈套抑制血管内皮细胞炎性反应的实验研究
炎症介质过度释放贯穿全身炎症反应综合征(SIRS)、多脏器功能障碍综合征(MODS)始终,是病情恶化的首要原因.核转录因子κB(NF-κB)在炎症介质的调节中起主要作用[1].临床上多种手段可以抑制NF-κB的活性[2].但特异性差,副作用多.NF-κB能特异性识别并结合目的基因上的κB序列 [1,2],利用这个特性,合成一包含κB序列的双链寡聚脱氧核苷酸(dsODNs)并转入靶细胞核,竞争性结合核内激活的NF-κB,可以阻断其促炎症反应活性[3,4].这一策略也被称为decoy.在此我们以脂多糖(LPS)激活人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)NF-κB活性,观察NF-κB-decoy对NF-κB活性的影响,探索一种抑制SIRS、MODS发病过程中炎症过度激活的分子策略.
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FAK反义寡聚脱氧核苷酸对FN诱导Hela细胞MMP-2表达的影响
目的:利用反义核酸技术探讨纤黏连蛋白(fibronectin,FN)诱导Hela细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)基因表达的机制.方法:无血清培养Hela细胞,以不同浓度及作用时间的FN诱导Hela细胞中MMPs基因表达,并用反义寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)封闭焦点黏着激酶(focal adhesion kinase,FAK),用酶谱分析方法检测MMPs的活性.结果:FN浓度为0μg/mL时,Hela细胞无MMP-2基因表达;FN浓度为5μ/mL～10μg/mL、作用时间为12 h,MMP-2活性大;当在培养液反义ODN后,MMP-2活性明显降低.结论:MMP-2基因表达与FN的浓度以及作用时间有关;FN可通过其整合素受体的信号转导通路启动Hela细胞中MMP-2基因表达、降解ECM,从而促进肿瘤的浸润和转移.
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血管内皮细胞生长因子反义寡聚脱氧核苷酸对视网膜新生血管的影响
目的探讨血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODNs)对增生性视网膜病变视网膜血管发育及新生血管形成的影响.方法注射血管内皮细胞生长因子反义寡聚脱氧核苷酸干预高浓度氧诱导SD幼鼠建立的增殖性视网膜病变动物模型,取眼球作病理切片,计数视网膜新生血管芽、测量视网膜内血管横断面积并比较.结果球后注药组和静脉注药组视网膜新生血管芽细胞核数均明显低于未用药组(P＜0.01);球后注药组与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);而静脉注药组则显著高于正常对照组(P＜0.01).球后注药组(P＜0.01)和静脉注药组(P＜0.05)视网膜内血管横断面积均显著低于正常对照组,球后注药组亦明显低于未用药组(P＜0.05).结论VEGF ASODNs能在明显抑制视网膜新生血管形成的同时,影响新生幼鼠视网膜血管的正常发育,且局部用药作用明显优于全身给药.
关键词： 增生性视网膜病变 血管内皮细胞生长因子 寡聚脱氧核苷酸 视网膜新生血管 -
血管内皮生长因子反义寡聚脱氧核苷酸与碘油混合栓塞治疗大鼠肝癌的实验研究
目的观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,asODN)抑制体外培养的Walker-256瘤细胞VEGF表达的情况,评价其与碘油混合行肝动脉栓塞对大鼠肝癌的治疗效果.方法将反义和正义VEGF寡核苷酸加入无血清培养的Walker-256瘤细胞的培养液中,48 h后酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定上清VEGF含量,并观察上清刺激血管内皮细胞(ECV-304)生长受抑情况.30只Walker-256移植性大鼠肝癌模型数字法随机分成3组,分别经肝动脉注入超液态碘油(UFLP)0.2 ml(UFLP组,n=10),UFLP 0.2 ml+VEGF asODN 3 OD混合物(UFLP+asODN组,n=10),生理盐水0.2 ml (对照组,n=10).于术前及术后第7天行MR检查观察肿瘤的体积,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测瘤内及瘤周VEGF mRNA含量,免疫组织化学法检测肿瘤组织 VEGF的表达及微血管密度(microvessel density, MVD).结果 VEGF asODN可以明显抑制培养的Walker-256瘤细胞VEGF的表达.动脉栓塞实验中,UFLP+asODN组肿瘤生长率明显低于UFLP组和对照组[分别为(140.1±33.8)%、(177.9±64.9)%和(403.9±69.4)%;F=60.02,P<0.01].瘤内及瘤周VEGF mRNA含量UFLP+asODN组低,对照组其次,UFLP组高.UFLP组、对照组、UFLP+asODN组肿瘤组织VEGF表达阳性率差异无显著性意义(分别为90%、70%、50%,P＞0.05),UFLP+asODN组肿瘤组织MVD值为53.1±18.4,明显低于对照组(73.2±20.4)和UFLP组(80.3±18.5)(F=5.44,P<0.05).结论 VEGF asODN可以抑制Walker-256瘤细胞VEGF的表达.与单纯碘油栓塞相比,VEGF asODN与碘油混合肝动脉栓塞可以明显降低肿瘤的生长率,减少肿瘤组织VEGF的表达及微血管密度.
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内皮素反义寡聚脱氧核苷酸抑制肾小球系膜细胞增殖
目的:应用反义寡核苷酸技术,对培养的人肾小球系膜细胞(glomerular mesan gial cells, GMC)进行内皮素-1(endothelin,ET-1)基因表达的抑制试验,探讨ET - 1基因表达与GMC增殖效应的关系.方法:以阳离子脂质体lipofectin介导的基因转移方法, 将前内皮素原ppET-1的反义寡聚脱氧核苷酸(a ntisense oligodeoxynucleotide,As-ODN ) 及其对照序列正义寡聚脱氧核苷酸(sense oli godeoxynucleotide,Se-ODN)、错配寡聚脱氧核苷酸(mismatch oligodeoxynucleotide,Mi s-ODN) 分别导入GMC. 通过生物素标记的 As-ODN显色反应,观察寡聚脱氧核苷酸的转移效果;用半定量反转录聚合酶链反应(rever s e transcription-polymerase chain reacti on,RT-PCR)检测寡核苷酸链对GMC的ppET- 1 m RNA表达的影响;用放射免疫分析(radio im munoassay,RIA)观察寡核苷酸链对GMC的ET- 1 蛋白分泌的作用;用氮蓝四唑盐(MTT)试验分析寡核苷酸链对GMC增殖的效应.结果:寡核苷酸链被转移入GMC.10 nmol*L-1 As-ODN抑制了GMC的ppET-1 mRNA表达、ET-1蛋白合成和细胞增殖 (各组P<0 .05).结论:特异抑制GMC的ppET-1基因表达能够抑制其增殖,证实GMC 产生的ET-1能刺激GMC自身的增殖,ET-1是GMC自分泌炎症介质之一.
关键词： 寡聚脱氧核苷酸 反义/药理学 内皮缩血管肽类 肾小球 系 膜/药物作用 -
免疫抑制剂寡聚脱氧核苷酸(ODN)的研究进展
抑制性ODN的来源包括病毒基因组,哺乳动物染色体端粒,甲墓化修饰的双链DNA人工合成的ODN,碱基替换的CG ODN及单核苷酸重复序列.目前已知的ODN多含有1530个核苷酸,骨架结构大多经过了硫代修饰.它们具有拮抗Toll样受体的功能,从而抑制免疫细胞被内外源性Toll样受体(TLR)的配体激活.随着对抑制性ODN研究的增多,对其研究的热点集中在了应用其治疗TLR活化的相关疾病及自身免疫病.
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CpG-ODN疫苗佐剂的研究进展
含胞嘧啶-鸟嘌呤（ CpG ）二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸链（ CpG-ODN）是一种具有巨大开发潜力的佐剂，这是一类合成的、包含有1个或多个非甲基化的CpG基序的单链DNA。研究表明， CpG-ODN能够选择性地增强脊椎动物的细胞和／或体液免疫应答，有效提升多种疫苗的免疫效果［1］。它能直接活化树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，增强抗原提呈能力，促进抗体的分泌；间接活化T细胞和NK细胞等免疫效应细胞，增强其功能及细胞因子的分泌，诱导Th1型免疫应答，产生细胞及体液免疫，因此， CpG-ODN是一种理想的疫苗佐剂。目前国外研究CpG-ODN作为感染性疾病和肿瘤疫苗佐剂已进入Ⅰ／Ⅱ期临床试验阶段［2，3］，并已证实CpG-ODN是一种高效低毒的新型免疫佐剂。
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寡聚脱氧核苷酸协同扶正清解方抗肝癌细胞侵袭转移作用
目的 探讨寡居脱氧核苷酸(ODN)协同扶正清解方对肝癌细胞侵袭转移的抑制作用.方法 将对数生长期的肝癌细胞HEPG2分为3组培养,Medium组、ODN组及ODN+扶正清解方组,分别在细胞培养液、含ODN的细胞培养液、含ODN和扶正清解方的细胞培养液中培养12、24、36、48、60、72、84 h.然后通过MTT法测定各组肝癌细胞的增殖情况、划痕实验检测肝癌细胞迁移能力、Transwell小室检测肝癌细胞侵袭转移能力.结果 MTT实验表明ODN+扶正清解方组的HepG2细胞的生长在第24h开始受到抑制,其细胞增值能力明显低于Medium组及单独ODN组(P<0.05);迁移实验显示ODN+扶正清解方组的肝癌细胞与对照细胞相比,更少的细胞发生了迁移(P<0.05);Transwel实验显示,ODN+扶正清解方组HepG2细胞加入Transwel上室以后24 h,穿过Matrigel胶的细胞数目显著低于对照组细胞(P<0.05).结论 ODN协同扶正清解方通过抑制肝癌细胞的增殖、迁移,降低了肝癌细胞的侵袭转移能力.
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3种免疫调节性寡聚脱氧核苷酸佐剂体外免疫活性的比较
目的 比较用于乙型肝炎疫苗的3种寡聚脱氧核苷酸(CpG-oligodeoxynueleotide,CpG ODN)佐剂体外的免疫活性.方法 分别将CpG ODN 684(沃森公司)、CpG ODN 1018(Dynavax公司)和CpG ODN 7909(Coley公司)序列体外刺激免疫人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和人树突状细胞系GEN,采用氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法检测人PBMC增殖活力,ELISA法检测GEN细胞中IL-6和IFNα水平.结果 CpG ODN 7909、CpG ODN 1018和CpG ODN 684诱导人PBMC的增殖水平明显高于未刺激的对照组,差异有统计学意义(P＜0.000 1),其中CpG ODN 684和CpG ODN 7909序列诱导人PBMC的增殖水平相似,略高于CpG ODN 1018序列;3种CpG ODN在体外对免疫细胞均具有明显的活化作用,其中CpG ODN 684和CpG ODN 7909序列体外活化免疫细胞产生的IL-6和IFNα水平相似,但高于CpG ODN 1018序列.结论 沃森公司CpG ODN 684序列体外活化免疫细胞功能与Coley公司CpG ODN 7909序列相似,略优于Dynavax公司CpG ODN 1018序列.
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核因子-kappa B反义核苷酸对小鼠移植心脏存活时间的影响
目的:设计特定的反义硫代寡聚脱氧核苷酸(ODN)来特异性地抑制小鼠核因子-kappa B(NF-κB)的mRNA,并观察其对小鼠移植心脏存活时间的影响 .方法:将30只小鼠随机分成NF-κB反义ODN给药组、碱基错配ODN对照组和未给药组,小鼠心脏移植血管重建后经腹腔缓释泵分别以12.5mg*kg-1*d-1 的剂量全身给予NF-κB反义ODN和碱基错配ODN,持续给药14d,而未给药组不给药物.观察受体小鼠移植心脏存活时间;术后d 7各组分别处死5只小鼠,测定受体小鼠脾细胞的混合淋巴细胞培养(M L C)和细胞毒T细胞(CTL)活性.结果:给药组小鼠的移植心脏存活时间较对照组和未给药组明显延长(P＜0.05);MLC显示给药组小鼠脾细胞对供体抗原刺激的增殖反应受到抑制(P＜0.05);给药组受体小鼠的脾细胞的CTL活性也明显减弱(P ＜0.05).结论:NF-κB反义ODN能有效抑制受体对小鼠移植物的细胞免疫反应,使同种异体的心脏移植存活时间延长.
关键词： 核因子-kappa B 寡聚脱氧核苷酸 缓释泵 小鼠心脏移植 免疫抑制 -
反义bcl-2基因抗白血病作用的研究
目的研究反义bcl-2基因抗白血病作用及其特点,探讨反义基因或联合药物体外净化和治疗白血病可行性. 方法 (1)RT-PCR和蛋白印迹方法检测HL-60、U937、K562、CEM白血病细胞株以及常见白血病类型的bcl-2 mRNA和P26蛋白表达情况.(2)选择高表达bcl-2基因的HL-60细胞株作为靶细胞,用人工合成bcl-2正反义硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODN)体外培养处理.检测bcl-2 mRNA和P26蛋白的变化;DNA梯形分析细胞凋亡,锥虫蓝拒染法和克隆培养观察细胞生长;同时将HL-60细胞与PS-ODN培养孵育7天后的活细胞腹腔接种Scid鼠,半巢式RT-PCR和病理分析该HL-60细胞在体内生物学行为改变.(3)建立三种白血病细胞株CEM、K562、HL-60 Scid鼠白血病模型和有效监测与追踪白血病细胞株的方法,掌握体内白血病细胞株生物学行为;用bcl-2正反义PS-ODN腹腔给药治疗HL-60 Scid鼠白血病模型,观察治疗后体内白血病进展变化.(4)用RT-PCR方法克隆bcl-2基因和构建其两种不同的反义RNA逆转录病毒表达载体.(5)转染高表达bcl-2的HL-60细胞,比较两种反义RNA在对抗bcl-2的作用与降低内源性bcl-2蛋白水平上的异同性.观察两种反义RNA介导的靶基因抑制对烷化溶血磷脂(ALP)和四种化疗药物诱导的HL-60细胞凋亡的影响.(6)RT-PCR检测基因转染HL-60在化疗药物作用下FGFβ\-1表达. 结果 (1)白血病细胞株表达bcl-2有差异,bcl-2 mRNA和它的P26蛋白不平行.(2)三种白血病细胞株HL-60,K562,CEM可在Scid鼠增殖,产生典型白血病浸润模型特征,白血病增殖和浸润程度与白血病细胞生物特性有关,其顺序为CEM>K562>HL-60.(3)人工合成的bcl-2反义硫化寡脱氧核苷酸(ASPO)能够下调HL-60细胞bcl-2表达,诱导凋亡,抑制增殖和克隆形成;同时使其失去在体内的致白血病能力.(4)bcl-2反义硫代寡脱氧核苷酸,腹腔给药能够抑制肿块增长,白血病扩张,延长Scid鼠生存期,呈剂量依赖性.(5)部分编码区的反义RNA能够降低HL-60细胞内源性Bcl-2蛋白水平,提高ALP和四种化疗药物对HL-60杀伤率,促进它们诱导的HL-60细胞凋亡.(6)反义基因转染的HL-60细胞在化疗药物作用下负调控因子TGFβ\-1基因表达增加. 结论 bcl-2反义基因可有效对抗bcl-2原癌基因表达,发挥明显的抗白血病作用,为体外净化白血病细胞和体内治疗白血病提供依据.
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白芍总苷对系统性红斑狼疮患者外周血B细胞内TLR9表达的影响
目的：探讨白芍总苷(TGP)对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血B细胞内Toll样受体9(TLR9)表达的影响。方法选取SLE患者60例和正常健康人30例,分离外周血单个核细胞( PBMC),每份标本均分为4组体外培养,即空白对照组、胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤-寡聚脱氧核苷酸( CpG-ODN)组、CpG-ODN+TGP 组和 TGP 组。空白对照组仅加入RPMI-1640完全培养液,其他3组分别加入CpG-ODN( ODN终浓度1μmol·L-1)、CpG-ODN+TPG( TPG适终浓度为1×10-4 mol·L-1)、TPG。各组均培养48 h后提取细胞,应用流式细胞仪检测各组B细胞内TLR9表达。结果①正常健康人：CpG-ODN组和空白对照组TLR9的表达率分别为(9.10±2.12)%,(4.96±2.11)%(P<0.01)；②SLE患者：CpG-ODN组的TLR9表达率(14.86±3.42)%,显著高于空白对照组的(9.20±3.43)%(P<0.01),CpG-ODN+TGP组的TLR9表达率(11.95±3.63)%,低于CpG-ODN组(P<0.05)；在SLE轻度活动患者中,CpG-ODN组和空白对照组TLR9的表达率分别为(10.74±3.17)%,(5.19±2.05)%(P<0.05)；在SLE中重度活动患者中,CpG-ODN组和空白对照组TLR9的表达率分别为(16.51±1.72)%,(10.80±2.37)%(P<0.01),CpG-ODN+TGP组TLR9的表达率(13.59±2.58)%,低于CpG-ODN组(P<0.01)。结论 TGP可以拮抗CpG-ODN对B细胞内TLR9表达的上调作用。
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寡聚脱氧核苷酸抑制巨噬细胞NF-κB活性的实验研究
目的观察寡聚脱氧核苷酸(ODN)对THP-1细胞NF-κB核转位及细胞核内结合活性的抑制作用.方法用脂质体将寡聚脱氧核苷酸转入细胞后,以细菌脂多糖(LPS)刺激30min,分别通过免疫细胞化学、电泳迁移率分析(EMSA)和RT-PCR检测细胞NF-κB的核移位和细胞核内NF-κB结合活性.结果免疫细胞化学显示转入ODN后以LPS刺激,NF-κB表达仍位于细胞浆内,EMSA显示ODN可明显抑制细胞核内结合活性,RT-PCR显示ODN能够明显抑制NF-κB相关炎性因子TNF-αmRNA的合成.结论ODN能有效抑制THP-1细胞NF-κB的核移位和细胞核内NF-κB结合活性,从而抑制相关炎性基因的启动和转录.
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免疫调节性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立、优化和应用
目的:建立一套合理而便捷的实验体系,为开发新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)提供筛选方法.方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(PBMC)作为研究对象,分别以细胞的增殖程度和刺激上清的抗病毒活性作为检测指标,优化各项实验条件,综合评定寡聚脱氧核苷酸的免疫调节活性.结果:成功建立了由阳性免疫调节性ODNA151抑制CpG ODN诱导的人PBMC增殖及抗病毒活性的筛选方法.结论:免疫调节性ODN筛选方法的成功建立,为下一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础.
