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脂质过氧化对人血管内皮细胞NO合成的影响及维生素E的作用
一、材料与方法1. 细胞培养：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养采用本实验室改进的Jaffe培养法。经免疫荧光检测第Ⅷ因子相关抗原阳性，鉴定为血管内皮细胞。
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含CpG基序的大肠杆菌DNA对柯萨奇病毒基因免疫的增强作用
柯萨奇病毒B组(CVB)有6个血清型,即CVB1～6.由于CVB血清型多,采用传统疫苗预防本病难度较大.为此我们构建了CVB1/B3型VP1基因重组质粒pCR3-uniB1B3,将该重组质粒转染后进行RT-PCR及免疫荧光检测,证明该表达系统可以在细胞内获得瞬时表达,并应用该质粒免疫BALB/c小鼠,免疫后小鼠体内产生了相应的抗体,但是其抗体水平并不令人满意.为了获得更好的免疫效果,本研究探讨了大肠杆菌CpG DNA作为免疫佐剂以期增强pCR3-uniB1B3的免疫效果.
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两种方法在检测艾滋病病毒高危感染人群中的评价
目前我国人类免疫缺陷病毒(HIV)的筛查,常用酶联免疫吸附试验(ELISA),以检测抗体的第三代试剂为主.近年来国外采用全自动酶联免疫荧光检测(ELFA)系统筛查HIV感染者.我们用上述两种方法对39份血清标本进行比较,并用WEST-BLOT作为确诊试验.
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人鼠嵌合Fab抗体通用表达载体的构建和抗人肝癌相关抗原HAb18G嵌合Fab抗体的表达
目的:构建一个在大肠杆菌中表达人鼠嵌合Fab抗体的通用载体,并用于抗人肝癌相关抗原HAb18G人鼠嵌合Fab抗体的表达.方法:利用特异引物PCR扩增人IgG3的CHl和Ck基因,分别克隆到表达载体pComb3中,从而构建成人-鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体pComb3C.然后将扩增的mAbHAbl8的VL和VH基因分别组装到通用表达载体中,酶切去除gⅢ片段后,连接成为HAb18嵌合Fab抗体的分泌型表达载体pComb3C/cFab.转化大肠杆菌后诱导其表达,通过ELISA检测产物的表达和定位.后,利用亲合层析纯化表达产物,进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,同时采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的亲和力和特异性.结果:测序及酶切鉴定表明,人IgG3的CHi和Ck基因正确插入到pComb3中,大小分别为324bp和333 bp,同时mAb HAb18的嵌合Fab基因也分别获得正确组装和表达.表达产物的分子质量约为45 ku,主要位于周质腔中.另外,ELISA和免疫荧光检测证实,表达产物含有人的抗体片段,并具有与相应抗原特异结合的活性,亲和力约为亲本抗体的10%.结论:成功构建了人鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体并制备了抗人肝癌小分子嵌合Fab抗体,为其进一步在肝癌诊断与治疗中的应用奠定了基础.
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细胞角蛋白20对膀胱癌早期诊断的前瞻性研究
新近研究发现，细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）是一种极有可能成为诊断膀胱癌及其随访的特异性生物标记物［1，2］。为此，我们对CK20在膀胱癌的早期诊断中的应用进行了初步探讨。 1．资料与方法：62例肉眼血尿患者，其中膀胱肿瘤术后随访发现血尿42例作前瞻性分析。所有患者进行膀胱镜检查及尿脱落细胞学和CK20检测。分析参数包括肿瘤数目、大小及WHO分级，术前或活检前留取尿液行脱落细胞学和CK20标志物免疫荧光检测。 收集晨起第1次新鲜尿100 ml。尿脱落细胞学检查按常规方式进行。将收集的尿液用Hanks液洗涤2次，1?500 r/min，5 min，收集沉淀细胞，以完全RPMI 1640培养基将沉淀细胞制成细胞悬液(2×105/ml)，37 ℃温箱中贴壁孵育6 h。原位冷丙酮固定10～15 min，用PBS洗涤3×3 min后，滴加抗CK20单抗，置湿盒内4 ℃过夜；PBS洗涤3×3 min后滴加荧光标记抗体羊抗鼠IgG-FITC 1∶10，37 ℃,40 min；PBS洗涤3×3 min后，荧光显微镜下观察并摄片。细胞浆和细胞膜发黄绿色的荧光为阳性反应。
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直接免疫荧光技术在大疱性皮肤病诊断中的意义
我们对15例大疱性皮肤病患者采用直接免疫荧光检测其抗体,并与病理检测结果进行对比,报告如下.
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三种方法对禽鹦鹉热嗜性衣原体疑似病例病原的流行调查
目的 利用免疫荧光抗体法、PCE-ELISA、PCR法分别检测北京市及周边地区禽鹦鹉热嗜性衣原体疑似病例的病原,以了解和评价该病原流行状况.方法 收集临床疑似禽衣原体的父母代、商品代家禽、SPF鸡喉头拭子、气囊组织、子宫黏膜,组织标本固定后采用直接免疫荧光染色测定衣原体包含体;喉头拭子、子宫黏膜处理后以PCE-ELISA定量测定衣原体;以衣原体保守性高的序列设计CTU/CTL引物扩增病料组织的omp-1基因片段.结果 直接荧光染色法显示家禽衣原体平均阳性率为38.7%,组织检出率依次为子宫黏膜、气囊、喉头拭子;PCE-ELISA检测显示平均阳性率为58.7%,其中SPF鸡阳性率为10.0%,健康肉鸡达到30.0%;PCR法检测家禽衣原体平均阳性率为71.6%, SPF鸡为10.0%.样本的目的 基因与标准禽衣原体6BC同源性超过99%.结论 种禽场和商品养殖场均发现疑似病例中禽鹦鹉热嗜性衣原体感染情况较为严重.荧光抗体染色、PCE-ELISA可用于临床实践中进行快速、准确检测.
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火把花根片治疗ⅠgA肾病60例临床观察
ⅠgA肾病(ⅠgAN)在我国发病率较高,占原发性肾小球疾病的1 3～1/4[1,2].目前大多数肾脏病学者均采用糖皮质激素、细胞毒类药等治疗,疗效一般且毒副反应大.我们采用火把花根片治疗ⅠgAN,旨在评价其临床疗效及副作用.1 临床资料94例系1997年6月～2000年4月住院经肾活检确诊的ⅠgAN,男58例,女36例,年龄12-46岁,平均28.8岁,病程1月-15年,平均28个月.所有病例肾活检常规作光镜、免疫荧光检测,部分病例分送电镜检查,病理按1982年WHO分类及参照毕增祺分类标准[3],并排除ⅠgAN肾病综合征型及由过敏性紫癜、SLE、干燥综合征等所致的继发性ⅠgAN.
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韦格纳肉芽肿病肾移植术后5年一例
韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis,WG)是一种主要侵犯小血管的系统性坏死性肉芽肿性血管炎,病程中80%可出现肾脏受累,一旦出现多为急进性肾小球肾炎,病理特点为局灶性、节段性、新月体性坏死性肾小球肾炎,免疫荧光检测少或无免疫球蛋白及补体沉积，90％病情活动者血清胞质型抗中性粒细胞胞质抗体(cANCA)阳性[1]。
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血小板配型:微柱凝胶免疫检测
临床血小板输血前进行的配型试验是检测病人血清中抗体与供者血小板抗原的相容性,筛选与病人血型相容的血小板.血小板细胞膜有3类同种异体抗原:ABO抗原、HLA-I类和血小板特异性抗原;ABO血型的相容性可由检测红细胞确定,检测HLA和血小板血型的方法都比较复杂,如血小板免疫荧光检测、ELISA、混合红细胞粘附分析,特异性单克隆抗体血小板抗原固定检测等.因为缺少简单、快速、准确的检测方法,临床常规至今不能进行血小板的HLA和血小板血型配型检测.与血小板血型有关的临床上较常见的疾病和征状:血小板输血无效症、胎儿和新生儿同种免疫血小板减少症、输血后血小板减少性紫癜等,对这些疾病预防、诊断和治疗都迫切需要能用于常规的血小板血型检测方法.应用本室创建的微柱凝胶免疫检测技术创新建立了简单、快速、可靠的血小板配型试验方法.
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重庆地区冬季小儿下呼吸道感染病毒病原学研究
目的了解重庆地区冬季小儿急性下呼吸道感染(ALRI)中病毒病原学构成,探讨其鼻咽分泌物病毒抗原与血清ELISA病毒抗体检测对ALRI的临床诊断价值.方法对2813例ALRI住院患儿中875例取鼻咽分泌物标本免疫荧光检测7种呼吸道病毒抗原(RSV、ADV、IA、IB、PIV1、PIV2、PIV3),1938例用ELISA方法检测3种病毒(RSV、ADV、CMV)血清IgM或IgG抗体.结果875例病毒抗原检测阳性358份(40.91%),其中RSV阳性318份(36.34%),PIV3阳性32份(3.66%),ADV为6份(0.69%),IA为2份(0.23%),IB、PIV1、PIV2均为0份;1938例血清ELISA病毒抗体检测阳性824份(42.52%),RSV-IgM阳性139份(7.17%),ADV-IgM阳性82份(4.23%),CMV-IgM阳性289份(14.91%),CMV-IgG阳性679份(35.04%).结论重庆地区冬季小儿ALRI中病毒感染率高,抗原与抗体阳性检出率分别为40.91%与42.52%,抗原检测显示RSV感染居第1位.病毒抗原免疫荧光检测与临床诊断符合率高,对临床病原诊断更有意义.
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PKGⅡ对胃癌SGC-7901细胞增殖相关的MAPK/ERK下游信号分子的抑制作用
目的:探讨cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(cGMP-dependent protein kinase Ⅱ,PKG Ⅱ)对人胃癌SGC-7901细胞增殖相关的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)下游核糖体S6激酶1(ribosomal S6 kinase 1,RSK1)和原癌基因c-Jun、c-Fos的作用.方法:用腺病毒Ad-LacZ和Ad-PKG Ⅱ感染SGC-7901细胞,使细胞高表达PKG Ⅱ;用特异性PKG Ⅱ激活剂8-pCPT-cGMP[8-(p-chlorophenylthio)-cyclic GMP]作用于感染了腺病毒的细胞,再用表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)进行刺激.MTT法检测PKG Ⅱ对EGF刺激引起的SGC-7901细胞增殖的影响,RT-PCR法和蛋白质印迹法分别检测PKG Ⅱ对EGF引起的SGC-7901细胞中c-Jun、c-Fos mRNA和p-RSK1、c-Jun、c-Fos蛋白表达的影响,免疫荧光显微镜下观察p-RSK1在SGC-7901细胞核内的分布情况.结果:8-pCPT-cGMP作用于感染了Ad-PKG Ⅱ的SGC-7901细胞后,EGF对SGC-7901细胞的增殖促进作用和EGF诱导的c-Jun、c-Fos mRNA和蛋白的表达受到抑制,RSK1 (Ser380)磷酸化水平明显降低；EGF刺激后,SGC-7901细胞核内大量累积p-RSK1,8-pCPT-cGMP作用后细胞核内p-RSK1减少.结论:激活的PKG Ⅱ可有效抑制EGF诱导的胃癌细胞的增殖、RSK1 Ser380位点的磷酸化、p-RSK1在细胞核内的累积以及原癌基因c-Jun和c-Fos的表达.
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人FcγRⅡ真核表达质粒的构建及稳定转染细胞系的建立
目的:建立稳定表达人FcγRⅡ(human Fc gamma receptor Ⅱ ,huFcγRⅡ)的真核细胞系,为后续研究奠定基础.方法:采用RT-PCR方法从人外周血白细胞合成FcγRⅡcDNA,构建huFcγRⅡ表达质粒pcDNA3-huFcγRⅡ,经酶切和PCR鉴定后,将pcDNA3-huFcγRⅡ质粒通过脂质体转染法转染COS7细胞,并经G418筛选获得稳定表达huFcγRⅡ的细胞克隆.采用免疫荧光法和玫瑰花环试验检测huFcγRⅡ的表达.结果:构建的pcDNA3-huFcγRⅡ真核表达质粒经酶切鉴定与预期一致,稳定转入COS7细胞后,经免疫荧光染色,约90%的转染细胞可见荧光,而未转染的COS7对照细胞未见荧光.结论:成功构建pcDNA3-huFcγRⅡ真核表达质粒,建立了稳定表达huFcγRⅡ的细胞系,为进一步研究奠定了基础.
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一步法实时RT-PCR快速检测手足口病肠道病毒
目的 探讨实时荧光RT-PCR在手足口病(HFMD)肠道病毒快速检测中的应用价值.方法 以实时荧光RT-PCR检测64例临床初诊为HFMD患儿标本中总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71),用RD细胞、Vero细胞和Hep-2细胞进行病毒分离培养,以免疫荧光法鉴别分离培养的EV71.结果 64例标本中,EV(+)/EV71(+)为23.4%(15/64)、EV(+)/CA16(+)为48.4%(31/64)、EV(+)/EV71(-)/CA16(-)为10.9%(7/64)、EV(-)/EV71(-)/CA16(-)为17.2%(11/64).实时荧光RT-PcR检测为EV71且病毒分离培养出现细胞病变效应的培养细胞经抗EV71单克隆抗体免疫荧光检测均为阳性,未发生细胞病变效应或非EV71的培养细胞均为阴性.结论 实时荧光RT-PCR检测HFMD病原具有特异和快速等优点,与病毒分离培养具有较高的一致性,可用于手足口病的早期诊断和鉴别诊断.
关键词： 手足口病 实时荧光RT-PCR 肠道病毒 免疫荧光检测 -
肿胀性红斑狼疮
肿胀性红斑狼疮(lupuserythematosustumidus,LET)是慢性皮肤型红斑狼疮(CCLE)的一个亚型,早由Gougerot和Burnier在1930年首次报道2例发生于面部的椭圆形、表面光滑、边界清楚的浸润性红斑,无瘢痕性斑块,次年他们又报道了具有相似皮损的3例患者.之后30年世界各地未见报道,直至1965年德国和法国的文献才有报道.1984年西班牙文献报告1例LET,皮损完全消退后无瘢痕和萎缩.1987年有作者提出LET是CCLE的临床和组织病理上的一个异型,很难与多形性日光疹和Jessner皮肤淋巴细胞浸润症鉴别.直到近,LET才引起人们的重视,逐渐从盘状红斑狼疮(DLE)、CCLE、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)中区分出来,成为一个单独的亚型[1-4].LET的一个主要特征是光敏感,且光敏感与抗Ro/SSA抗体无直接关系[5],免疫学指标和实验室检查多数正常.其组织病理学的主要特点是真皮网状层粘蛋白沉积,且直接免疫荧光检测为阴性[6].氯喹和羟氯喹治疗有效.
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全自动酶免疫荧光分析仪检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染的评价
近年来 , 欧美国家广泛采用全自动酶免疫荧光检测系统检测泌尿生殖道标本中的沙眼衣原体 , 标本采用男性尿液或尿道拭子、女性宫颈分泌物 , 临床使用方便 , 结果判断客观 [1- 3]. 我们于 2001年 4～ 6月 , 采用法国 bioMé rieux公司生产的 mini VIDAS全自动酶免疫荧光分析仪 作了男性尿液标本和女性宫颈拭子标本中的沙眼衣原体检测 ( VIDAS CHL检测法 ) , 并与 Clearview Chlamydia试验、衣原体培养及 PCR( Roche公司试剂盒 ) 检测进行了比较 , 现将结 果报道如下 .
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大鼠抗肠道病毒71型衣壳蛋白VP1特异性中和单克隆抗体的研制与应用
目的 研制大鼠抗肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1特异性中和单克隆抗体(单抗),并用Western印迹、ELISA和免疫荧光检测(IFA)等方法验证其特异性 方法 采用单克隆杂交瘤技术人工合成包含EV71 VP1中和抗原决定簇位点SP70的多肽偶联载体蛋白KLH,腹腔内注射免疫大鼠数次后,取有预期免疫应答的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选和有限稀释法亚克隆获得稳定的阳性单克隆杂交瘤细胞株并鉴定其IgG亚型.选取其中1株单克隆杂交瘤细胞系BC6,体外培养后注射于SCID裸鼠腹腔制备腹水以产生大量抗体,用Protein A层析柱亲合纯化后获得纯化抗体.细胞培养微量中和试验测定该单抗中和EV71的滴度,并将其用于多种方法检测EV71特异性抗原.结果 共获得8株稳定的单克隆杂交瘤细胞系,分别有6株属于IgG1亚型,2株为IgG2a亚型.通过制备腹水大量产生抗EV71大鼠单抗BC6并纯化,其对EV71的中和滴度为1∶32.BC6用于Western免疫印迹可特异检测大肠埃希菌表达的EV71 VP1重组蛋白和EV71样品中的VP1,用于ELISA可灵敏特异地定性或定量检测EV71抗原含量,用于IFA可特异识别被感染Vero细胞内的EV71颗粒,而对柯萨奇病毒A16型无交叉反应.结论 成功制备获得了大鼠抗EV71 VP1的特异性中和单抗,可应用于Western免疫印迹、ELISA、IFA等方法,成为灵敏特异地检测EV71 VP1或全病毒颗粒的有效工具.
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126例肾病患者行肾穿术前后的护理
因经皮肾活检术是一种有创伤性的诊疗手段,故在术前、术后应提供良好的护理,观察患者有无出血、感染尤为重要.我们总结了126例肾病患者行肾穿术前后的护理,现报告如下.1 一般资料本组收集的126例患者中,男80例,女64例;年龄小13岁,大45岁,平均23岁.除2例患者出现肾穿大出血、1例误穿肝脏外,其他病人均经肾穿刺活检术,肾组织免疫荧光检测确诊,并得到良好的治疗.
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2003-2007年重庆地区急性下呼吸道感染患儿病毒监测情况
目的 分析重庆地区急性下呼吸道感染(ALRI)患儿2003-2007年病毒病原学构成及变化情况,探讨鼻咽分泌物(NPS)病毒抗原检测与血清病毒抗体检测对ALRI患儿病原学诊断的价值.方法 2003年4月-2007年10月从2 529例ALRI住院患儿吸取了 NPS标本,采刚免疫荧光法检测7种常见的呼吸道病毒抗原:呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、A型流感病毒(IA)、B型流感病毒(IB)、副流感病毒1、2、3型(PIV1、PIV2、PIV3),采用EIJSA方法检测55 887例ADV病毒血清IgM抗体,其中45 159例采用同样方法检测了 RSV病毒血清IgM抗体.结果 2 529例呼吸道病毒抗原检测阳性778份(30.76%).其中RSV阳性668份(85.86%),PIV3阳性75份(9.64%),IA阳性20份(2.57%).ADV阳性15份(1.93%),PIV1阳性仪1份(0.13%),且与RSV协同阳性.病毒血清RSV-IgM检测各年阳性率为0.9%～15.2%,ADV-IgM检测各年阳性率为0.6%～10.6%.RSV感染主要在冬春季节好发.结论 重庆地区ALRI中病毒感染仍然是小儿ALBI的常见病原,且仍以BSV感染居首,有明显季节性,以冬春季节为著.2007年1-10月均能检测到RSV病原,阳性率在2月可达50%,提示2007年可能是RSV流行的高峰年.而PIV3、IA、ADV及PIV1感染率较低,IB及PIV2近5 a来均未发现.ILSV病毒抗原免疫荧光检测既快速又准确,与临床诊断较符合,优于抗体检测.实用儿科临床杂志,2009,24(10):768-770
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肾淀粉样变10例的临床病理分析
现将2006年1月至2011年12月我科10例肾淀粉样变患者临床病理进行分析.资料与方法1.临床资料:男7例、女3例,发病年龄32～79岁,平均55.4岁,病程1～31个月,3例低血压.均表现为肾病综合征,24 h尿蛋白定量3.76～10.6 g,1例镜下血尿,2例血肌酐分别为163 μmol/L、207μmol/L.7例心电图肢导联低电压,8例心肌肥厚.1例肺淀粉样变,皮肤淀粉样变、神经系统损害各3例.凝血功能障碍、合并糖尿病、继发于系统性红斑狼疮各1例,合并乙型肝炎2例.均行尿本周氏蛋白、血脂7项、血清蛋白免疫固定电泳、免疫球蛋白定量、乙肝两对半、丙肝抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体、胸X片、泌尿系B超,部分患者行骨髓穿刺细胞学检查,有皮肤损害的行皮肤活检并行刚果红染色,如阳性,则用高锰酸钾氧化试验.10例均行肾活检,肾组织光镜行苏木精-伊红染色、过碘酸雪夫氏染色、六胺银染色、Masson染色.冰冻切片免疫荧光检测IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q、纤维蛋白原.
