联胺诱导培养的人内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1

细胞黏附分子涉及许多生理和病理过程,如动脉粥样硬化(AS)[1].有些因素可能诱导细胞黏附分子的表达,如氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导培养的内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)[2].这提示细胞黏附分子可能是导致AS的一种重要因素.我们拟用氧化剂联胺处理培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),诱导其脂质过氧化损伤,观察其VCAM-1 mRNA和蛋白表达,为抗氧化剂防治AS提供实验依据.

同型半胱氨酸促进内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白1α

单核细胞迁入动脉内皮下间隙是动脉粥样硬化(AS)发生的早期事件[1].巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)对单核细胞有趋化作用.高同型半胱氨酸血症是AS的一个独立危险因子[2].我们观察同型半胱氨酸(HCY)是否诱导培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达MIP-1α,探讨HCY在AS形成中的作用.

人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究

目的 探讨从人外周血中大量培养树突状细胞(DC)的方法,并在表型、形态、结构等方面进行鉴定.方法 采用5步法从人外周血中大量培养DC:①Ficoll不连续密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC);② RPMI-1 640培养基离心洗涤去除血小板;③利用DC前体细胞的短暂粘附性去除悬浮细胞及粘附性较强的细胞;④用重组人白介素4(rhIL-4)、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)自外周血单个核细胞诱导分离DC;⑤用重组人肿瘤坏死因子诱导产生成熟的DC.用荧光显微镜检测DC表面分子的表达,在扫描电镜下观察DC的形态.结果 获得了具有典型特征的DC前体细胞,在GM-CSF和rhIL-4协同诱导9 d后,荧光显微镜下可见DC表面CD83、CD40、HLA-DR的表达.扫描电镜观察可见:DC细胞形态不规则,从胞体辐射状伸出数个粗细不等的突起,有的长度可达胞体的2～3倍,长突起存在分叉及汇合现象.在长突起的基部存在大量短小的圆形或椭圆形突起.结论 人外周血来源DC的5步培养法可获得较高数量的典型DC,且该法稳定、简便、经济,为DC的临床免疫治疗提供了实验依据.

人脐静脉血内皮克隆形成细胞的分离培养与鉴定

目的 体外建立一种简便的人脐静脉血内皮克隆形成细胞(ECFCs)分离培养方法,并对其进行鉴定.方法 无菌条件下收集脐静脉血,以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(MNCs),诱导分化为ECFCs,倒置显微镜下观察其原代及传代培养细胞生长状况并通过流式细胞仪、免疫细胞化学、荧光双染色对ECFCs进行鉴定.结果 ECFCs培养过程可出现边界清楚的类圆形单层鹅卵石样细胞集落,细胞增殖能力强,连续传十几代细胞形态稳定,ECFCs高表达内皮系细胞表面抗原,而不表达造血系表面标记；可吞噬Dil-ac-LDL并结合FITC-UEA-1.结论 通过简单、可靠的实验方法获得了ECFCs,为进一步探讨其生物学功能及临床应用提供了基础.

人胎儿骨髓间充质干细胞来源的类肝细胞的分子生物学鉴定

目的:对MMSCs来源类肝细胞进行分子生物学鉴定.方法:从人胎儿骨髓中分离MMSCs,在10 g/L Matrigel作基质,2.5 mmoL/L AZA预处理10-12 h,HGF 10 μg/L+FGF4 10μg/L+HGM培养基中培养和诱导.收集诱导培养4,7,14,21,28 d时的细胞爬片,SABC免疫组化法DAB显色检测肝细胞早期标志AFP,CK19及早期转录因子GATA4,成熟肝细胞标志ALB,CK18,GST-π,肝细胞转录因子HNF1α;提取诱导分化10 d和第28 d细胞RNA及蛋白质,设计AFP,CK19,ALB,CK18,CYP1B1,CYP2B6引物,进行RT-PCR,观察在mRNA水平肝细胞标志的表达,采用Western blot检测CK18,AFP,ALB的表达量.结果:未诱导培养的MMSCs中,有较少的细胞表达AFP,未见其他肝脏特有的转录因子或者胞质蛋白标志.免疫组化显示在诱导早期可见较多细胞呈GATA4,AFP和CK19阳性表达,至诱导后期表达下降,而ALB,CK18,GST-π和肝细胞转录因子HNF1α阳性细胞比例逐渐上升.RT-PCR显示,未诱导的MMSCs仅可表达微弱的AFP mRNA,诱导早期可见AFPmRNA和CK19mRNA表达,诱导后期未见扩增,而ALB,CK18,CYP1B1 mRNA早期和后期均可见表达,在诱导后期可见CYP2B6 mRNA表达,但很弱.Western blot检测显示诱导细胞中AFP,ALB和CK18蛋白的表达趋势同基因表达类似.在65 ku和68ku处诱导细胞组可见AFP和ALB目的条带,在45 ku处诱导细胞组可见CK18目的条带.未诱导的细胞和诱导早期细胞中AFP有表达,后期未见.诱导早期和后期CK18和ALB均有表达,且后期增强.结论:MMSCs向类肝细胞的横向分化是先分化为肝前体细胞,再分化为成熟肝细胞,在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞.

HGF和FGF4体外诱导人骨髓CD45-CD117-细胞向肝细胞分化的研究

目的:探讨在HGF、FGF4诱导下人骨髓CD45-CD117-细胞能否向肝细胞分化,并探讨两种生长因子在诱导分化中可能的作用机制.方法:骨髓来自4名4-40岁健康志愿者的胸骨或髂骨.用两步磁式分离法分离出CD45-CD 117-细胞,分别用含有FGF4,HGF,HGF+FGF4或不加生长因子的DMEM培养基进行培养,相应地分为A,B,C,D四组.分别于新分离时和培养7 d,14 d,21 d,28 d时留细胞.备作免疫细胞化学检测AFP,CK18,白蛋白,PAS染色检测糖原等肝系细胞的特征型标志,RT-PCR检测C、D组细胞c-met(HGF受体)和FGFR2(FGF4R)mRNA表达情况.结果:A,B,C三组加生长因子诱导培养后的细胞均可检测到肝系细胞的标志,D组细胞不加生长因子培养后没有检测到肝系细胞的标志.c-met和FGFR2mRNA在新分离的和D组培养7 d,14 d时的细胞均有较弱的表达,而在C组细胞诱导培养7 d,14 d时表达升高.结论:HGF和FGF4可诱导人骨髓CD45-CD117-细胞向肝细胞样细胞分化.生长因子诱导分化的作用可能通过与其受体之间的正反馈调节.

CIK细胞对G0 期急性髓系白血病细胞的杀伤作用

对于血液系统恶性肿瘤,化疗缓解后的微小残留病是患者长期生存的主要障碍.由于只有处于细胞周期白血病细胞对化疗敏感,有研究[1]表明残留白血病细胞多为G0期细胞.近年来诸多研究表明细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞对多种肿瘤细胞均有杀伤作用,但CIK细胞对急性髓系白血病(AML)中G0期白血病细胞杀伤作用的研究尚未见报道.本实验从完全缓解的白血病患者外周血中诱导培养CIK细胞,测定其扩增数量,观察其对自体G0期CD34+白血病细胞的细胞毒作用,为临床应用自体CIK细胞清除残存白血病细胞提供了理论依据.

中性蛋白酶Ⅱ消化法在神经元诱导培养中的应用

[目的]建立中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)对神经球的分散、消化及消化后神经元的诱导培养方法.[方法]取15d胎鼠的脑组织,经剪碎、研磨、血清培养基培养得到的神经球,培养2d后观察细胞贴壁情况,并换成诱导剂培养液培养3d,用DispaseⅡ消化已培养的神经球,后期将经DispaseⅡ消化后的细胞继续进行培养、诱导、鉴定.[结果]用DispaseⅡ消化神经细胞后体外培养并诱导,神经球能够诱导分化成神经元,并能形成典型的神经元细胞网状,经NSE鉴定阳性.[结论]利用DispaseⅡ消化的方法能够将神经球消化成单个细胞,消化后的细胞能够继续培养并向神经元分化.

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓内的一种多能干结缔组织前体细胞,具有多向分化潜能,也是有可能成为软骨组织工程的种子细胞来源.本文从BMSCs诱导成软骨细胞的方法和研究进展做一综述,如体外细胞团聚集诱导培养、体外单层细胞诱导培养、体外三维支架环境中诱导培养、体内软骨微环境诱导培养、和软骨细胞体外共培养诱导以及基因转染诱导培养等,这也是软骨组织工程研究中不可缺少的重要环节.

脱钙骨支架与诱导培养的脂肪基质细胞复合修复免胫骨缺损

背景:脂肪基质细胞经诱导后具备成骨活性已被实验证实,因此,脂肪基质细胞修复骨缺损的研究已成为目前的热点,但脂肪基质细胞修复负重骨缺损修复的相关实验报道较少.目的:通过兔脂肪基质细胞诱导培养为成骨细胞,并与牛脱钙骨复合培养,对兔胫骨骨缺损修复情况的观察,探讨脂肪基质细胞修复骨缺损的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-01/09在天津市第三中心医院动物实验室完成.材料:取新生小牛四肢长骨干干骺端的松质骨置于脱钙液中脱钙、脱脂、去细胞、去抗原和去蛋白等程序处理制备成脱钙骨支架.方法:选取健康成年新西兰大白兔12只,随机选取1只提取腹腔内脂肪组织15 mL,体外分离培养脂肪摹质细胞并行诱导培养证实为成骨细胞后,以1×109L-1浓度种植于脱钙骨支架上,继续培养1周,制成组织工程骨.将12只新西兰大白兔手术制成双侧胫骨骨缺损模型,左下肢植入单纯脱钙骨作为对照组,右下肢植入组织工程骨作为实验组.主要观察指标:X射线、CT检查观察骨缺损处骨痂形成情况,取材后行大体、组织学观察骨缺损处修复情况.结果:大体观察及X射线显示实验组术后12周骨缺损区缺损消失,已骨性愈合,对照组术后12周骨缺损区缺损仍存在,未见完全愈合.组织学观察显示实验组术后12周可见新生骨小梁形成,对照组术后12周未见新生骨小粱形成.测量CT值行配对t检验显示实验组明显优于对照组(P<0.05).结论:脂肪基质细胞经诱导培养具备成骨活性,与细胞支架复合具备修复骨缺损的能力.

生物反应器内工程化软骨的三维动态构建

组织工程化软骨的体外构建，可克服传统治疗方法的一些不足，被认为是一种有望治疗关节软骨缺损的有效途径。文章旨在探究人源脂肪干细胞结合壳聚糖/明胶水凝胶支架，在体外动态环境下构建工程化软骨的优势。实验制备了壳聚糖/明胶水凝胶支架，对其理化性能进行了检测，后将人源脂肪干细胞作为种子细胞，接种在支架上进行软骨的诱导培养，其中，选用转瓶作为动态的培养环境。分别通过组织学染色、共聚焦显微镜观察、扫描电镜观察等考察了软骨的构建情况，结果显示壳聚糖/明胶支架的平均孔径为(118.25±19.51)μm，孔隙率为(82.60±2.34)%，溶胀率为(361.28±0.47)%，弹性模量为(61.2±0.16)kPa，具有良好生物相容性。动态载支架-转瓶内水凝胶支架中细胞蛋白多糖的表达更显著，细胞生长分布更加均匀，分泌细胞外基质基本填满整个支架，可促进人源脂肪干细胞的软骨分化和体外软骨的构建。

短波紫外线照射诱导培养的人气管平滑肌细胞凋亡

气管平滑肌细胞(ASMCs)的增殖与临床许多病理过程有关，ASMCs的增殖是引起气道重塑的重要因素。而ASMCs的凋亡和增殖之间的动态平衡制约着这些疾病的发展。我们用短波紫外线(UVC)照射体外传代培养的人ASMCs，观察对其凋亡的影响。现报告如下。

阿霉素诱导人卵巢癌细胞耐药株的建立及多药耐药表型测定

[目的]探讨卵巢癌细胞多药耐药的发生机制,寻找克服及逆转卵巢癌多药耐药的方法.[方法] 采用阿霉素较大剂量间歇诱导和浓度梯度递增培养法,建立人卵巢癌耐药细胞株(SK-OV-3/adr).运用MTT法检测药物敏感性和细胞生长规律变化,流式细胞仪检测细胞周期分布,荧光显微镜观察耐药株细胞内药物含量变化.[结果]建立的SK-OV-3/adr对阿霉素、5-氟尿嘧啶、长春新碱、紫杉醇、足叶乙甙有明显的交叉耐药, 耐药指数分别为5.6(296.7/53.4 ng·mL-1)、6.3(12008.4/1921.6 ng·mL-1)、4.6(1176.2/254.3 ng·mL-1)、12.5(4269.6/342.0 ng·mL-1)、>10.9(>20000/1830.1 ng·mL-1).与卵巢癌细胞敏感株(SK-OV-3)相比,半数细胞抑制剂量IC50明显增加,差异有统计学意义(P<0.01).给予P-糖蛋白抑制剂(盐酸维拉帕米)时,交叉耐药性减弱.与SK-OV-3相比,SK-OV-3/adr细胞内阿霉素荧光强度明显变弱.[结论]建立了具有多药耐药表型的SK-OV-3/adr细胞株.

未成熟树突状细胞快速分离与体外诱导培养及其鉴定研究

目的:以人外周血来源的单核细胞为前体细胞,建立体外快速分离和诱导培养未成熟树突状细胞(Immature dendritic cell,iDC)的方法.方法:采用Ficoll密度梯度离心方法和MACS磁珠分选系统,收集高纯度CD14+单核细胞;用rhGM-CSF、rhIL-4联合诱导培养CD14+单核细胞,第4天获得未成熟树突状细胞(iDC),应用流式细胞术检测细胞表面标记(CCR5)和抗原吞噬能力,普通光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞表面和内部结构特征.结果:CD14免疫磁珠技术获得CD14+单核细胞纯度达94%以上,诱导分化第4天的iDC具有CCR5特征性标志和吞噬能力,普通光学显微镜及电镜观察到iDC出现树突状细胞典型特征.结论:体外快速诱导培养是获得大量具有典型特征的iDC的有效方法,并可应用于进一步实验研究.

骨髓间充质干细胞的体外培养及定向诱导分化

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养生长特性及其在体外定向分化为神经样细胞的条件.方法:采用Ficoll-paque(1.077g/ml)分离液密度梯度分离hMSCs,显微镜下观察其生长特性,测定生长曲线;取传至3～6代的hMSCs,用阿魏酸钠对其进行诱导培养,并以β-巯基乙醇作对照观察诱导培养后细胞的形态变化,分别在6h、1d、3d和7d通过免疫荧光细胞化学染色方法测定诱导后细胞的神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glia fiber acid protein,GFAP),进行定量分析.结果:体外培养条件下hMSCs呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,细胞倍增时间约为72h.阿魏酸钠诱导培养后6h可见细胞形态明显变化,NSE和GFAP表达阳性.24h后诱导细胞表现为典型的神经细胞样形态.第3天,NSE和GFAP表达高,分别为67±3.5%和39±1.8%.结论:人骨髓间充质干细胞在体外具有自我更新能力及多分化潜能;阿魏酸钠具有诱导体外培养的人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.

辛伐他汀对大鼠肝贮脂细胞血小板衍生生长因子效应的影响

血小板衍生生长因子(PDGF)在肝贮脂细胞(FSC)激活和增殖中起重要作用[1].研究显示,3-羟基-3-甲基戊二烯辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂能抑制多种细胞增殖,阻断生长因子对细胞的促进作用[2].因此,我们选用一种脂溶性HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀,观察其对PDGF诱导培养大鼠肝FSC增殖、胶原合成和细胞内Ca2+变化的影响.

人源性CD3抗体诱导食蟹猴T淋巴细胞培养方法的建立

目的:在初步分析人、食蟹猴和猪CD3蛋白同源性的基础上,建立利用人源性CD3抗体诱导食蟹猴外周血T淋巴细胞的体外分离培养技术.方法:从NCBI查询获取人类、食蟹猴和猪CD3蛋白各自的氨基酸序列,并用DNAMAN软件进行序列比对、同源性分析和构建系统进化树.Western blotting检测三种T细胞膜上CD3蛋白的表达水平.分离健康食蟹猴PBMC,分为3组,A组加入抗人CD3抗体单刺激、B组加入IL-2单刺激、C组加入抗人CD3抗体和IL-2共刺激.倒置显微镜下观察细胞生长状态并计数,绘制细胞生长曲线,锥虫蓝染色检测细胞活性,流式细胞术检测T细胞表面标志物CD3、CD4、CD8的表达.结果:食蟹猴、猪的CD3蛋白氨基酸序列与人类的同源性分别为86.9％、65.6％,T细胞膜上CD3蛋白的表达量分别为人的79％、17％.A组细胞不增殖;C组细胞增殖能力、细胞活性及CD3表达率[(93.8±3.6)％vs (70.3±4.7)％,P＜0.01]均显著高于B组,细胞生长曲线呈S形,符合Logistic生长曲线;C组T细胞高表达CD3,T细胞纯度较高,且CD8+T细胞占比较多.结论:食蟹猴外周血T淋巴细胞膜表面能表达和人同源性很高的CD3蛋白,在人源性CD3抗体、IL-2和1％PHA共刺激下能诱导食蟹猴外周血T淋巴细胞的增殖分化,获得生长状态良好、增殖能力强、纯度较高的T淋巴细胞.

体外骨髓间充质干细胞的诱导培养及其电生理特性的研究\体表心电图指标与阵发性房颤经导管射频消融术后复发的关系

小鼠骨髓来源肥大细胞的诱导培养及功能鉴定

目的：探讨体外诱导培养小鼠骨髓细胞来源肥大细胞的方法，为体外组胺激发试验提供试材。方法：采用白细胞介素3（IL-3）和干细胞因子（SCF）联合刺激小鼠骨髓细胞4、6周诱导其分化为肥大细胞，光镜下观察细胞形态，甲苯胺蓝染色观察细胞成熟度，蛋白免疫印迹法分析表面 FcεRⅠ和CD117表达情况， HistaReader 501组胺仪检测细胞脱颗粒能力。结果：诱导培养4、6周后的细胞为大小均一且具折光性的圆形悬浮细胞；甲苯胺蓝染色显示培养4、6周后的细胞胞核染为蓝色，胞质含有丰富的粗大紫红色颗粒，镜下统计成熟肥大细胞比例达85％以上；蛋白免疫印迹法分析发现培养4、6周后的细胞皆表达FcεRⅠ和CD117，其中培养6周的细胞FcεRⅠ表达水平更高；组胺仪检测培养6周的细胞发现，经浓度为100、500、1000μmol· L －1的钙离子载体刺激后，与阴性对照组相比，细胞组胺释放量依次为3.86％、17.04％及23.47％（ P＜0.05），其脱颗粒具有钙离子载体浓度依赖性。结论：获得大量高纯度的小鼠骨髓来源肥大细胞，可促进后期的组胺激发试验及Ⅰ型变态反应机制研究。

破骨细胞体外培养的影响因素

破骨细胞(OC)是人体生理性骨重建和病理性骨破坏过程中高度特异性的惟一具有骨质吸收功能的多核巨细胞,来源于造血干细胞的粒细胞-巨噬细胞集落形成单位.在体内它主要受骨髓基质细胞或成骨细胞分泌的破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony stimulating factor, M-CSF)两种分子的调控.在OC生成和分化的过程中,骨髓基质细胞、OB、OC间及M-CSF与RANKL间互相影响和依赖,形成某种"偶联"机制保持动态平衡[1].目前国内外对破骨细胞的研究主要针对OC的分化及其调节机制,但其分离、诱导培养的影响因素等方面总结性文献较少,本文就近年来破骨细胞体外培养的多种影响因素作一综述,以总结对破骨细胞的影响因素,提高培养破骨细胞的成功率、密度和纯度.