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重组SARS-CoV核衣壳蛋白的表达及免疫原性研究
我们利用全基因合成方式及原核表达系统获得大量纯化的N蛋白,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究提供新的思路.由于长片段目的基因在原核系统中不易表达,根据抗原性预测分析将N蛋白分成两部分表达,第一部分为N-1蛋白1～549 bp,第二部分为N-2蛋白496～1269 bp,上下游分别设计BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点,并将基因中包含这两种酶切位点的基因以无义读码方式进行突变,通过全基因合成分别将两段基因克隆至原核表达载体pET32a(+),由上海生工生物工程技术公司完成,测序证实序列无误.
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基孔肯雅病毒包膜蛋白E2的全基因合成及原核表达
目的 通过对全长基孔肯雅病毒包膜蛋白E2(CHIKV-E2,1~404 aa)及其跨膜疏水区(351~378 aa)缺失突变体E2(1~350 aa)进行原核表达,分析跨膜疏水区对E2蛋白在大肠杆菌中表达的影响.方法 利用ExPasy预测软件对E2蛋白跨膜疏水区进行预测分析,根据GenBank数据库中CHIKV-E2氨基酸序列获得其对应的基因序列.结合重叠延伸PCR(OE-PCR) 原理设计用于全基因合成的核酸引物对CHIKV-E2全长基因(404 aa)进行体外合成,构建全长E2蛋白及其缺失突变体原核表达质粒,将序列正确的两种重组质粒分别转至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组质粒的表达情况.结果 OE-PCR法成功合成了大小为1 212 bp的编码CHIKV-E2(1~404 aa)蛋白的全长基因,构建了全长E2蛋白及其缺失突变体重组表达质粒 pET21b-E2(1~404)和pET21b-E2(1~350),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示缺失突变体pET21b-E2(1~350)融合蛋白表达量较pET21b-E2(1~404)有明显提高.结论 E2蛋白跨膜疏水区(351~378 aa)对该蛋白的原核表达具有重要影响,缺失该疏水区的突变体在大肠杆菌中表达量比全长E2蛋白表达量明显提高.
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猪附红细胞体ORF4基因片段的人工合成及基因表达
目的 本研究通过人工合成猪附红细胞体ORF4基因,使其在大肠杆菌中高效表达.方法 选择GenBank注册的AJ504999序列的ORF4基因,应用Graphical Codon Usage Analyser选择大肠杆菌偏爱的密码子,改变基因的transl_table,设计并合成3对寡核苷酸链,用PCR-based accurate synthesis(PAS)法进行人工合成.经测序正确后,连接到表达载体PET28a,获得重组表达质粒PET28a/ORF4,导入大肠杆菌BL21(DE3),在30℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,在11 kDa附近出现目的片段.结果 结果表明ORF4基因在大肠杆菌中能够得到高效的表达,通过生物信息学软件分析表明,该蛋白存在19个配基结合位点;在21～22位氨基酸可能存在信号肽裂解位点;为胞内蛋白,没有糖基化位点.结论 ORF4基因能够在大肠杆菌中表达,推测其在M.suis蛋白质的形成,M.suis的生物功能方面有着重要的作用.
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影响人干细胞因子基因高效表达的因素探讨
目的分析SD序列长度、基因起始码ATG和终止码TAA上下游处RNA的二级结构及密码子偏性等影响表达效率的主要因素,以期实现重组人干细胞因子在原核细菌中高效表达.方法分析并修改编码人SCF氨基酸的密码子,分段合成改造后的基因,PCR一次性完成拼接,将基因克隆到pBV-220载体上,诱导表达.结果天然人SCF基因在pBV-220载体的表达占菌体总蛋白的9.5%,基因改造后SCF占菌体总蛋白的27%,表达的蛋白能够为SCF的单克隆抗体所识别,初步纯化的sCF蛋白纯度大于80%,能够促进Mo7e细胞的增殖活性.结论密码子偏性是影响SCF在原核细菌中高效表达的主要因素,通过改变密码子偏性能过实现高效表达.
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真核表达质粒PIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的:通过oligo化学合成及PCR扩增法合成人显性抑制TGF-βⅡ型受体目的基因,并建立其真核表达载体.方法: 根据Genebank数据库确定显性抑制TβRⅡ目的基因,利用化学合成法进行单链oligo的合成,PCR法将合成的oligo拼接成完整的序列,装入PMD18-T载体并转染感受态细胞DH5 .经XhoI和EcoRI酶切后连接至目的载体PIRES2-AcGFP中,转染COS-7细胞,对此质粒载体进行酶切电泳鉴定和DNA测序鉴定,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测DNTβRⅡ表达.结果: 合成DNA经测序验证与目的基因一致;PIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ转染COS-7细胞,实现了DNTβRⅡ目的基因在COS-7细胞中的体外转染及瞬时表达.结论: 采用oligo化学合成及PCR扩增法成功合成人显性抑制TGF-βⅡ型目的基因并构建了其真核表达载体PIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ,为进一步研究过继性免疫细胞治疗奠定了基础.
