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变异链球菌LuxS基因缺陷株的建立及其耐酸能力的研究
目的 建立LuxS基因缺失的变异链球菌突变菌株,并对突变株的耐酸能力进行研究.方法 以变异链球菌UA159为材料,运用基因重组方法将红霉素抗性基因(Eymr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到质粒载体PUC19的多克隆位点中,获得了具有红霉素抗性的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用红霉素抗性筛选出LuxS基因缺失的突变株.检测变异链球菌LuxS基因突变菌株在不同pH环境下生长情况,并以正常菌株为对照.结果 PCR基因扩增结果显示,突变株LuxS基因已被Eymr基因完全替换,不能再编码合成AI-2(autoinducer 2)信号分子,扩增产物经DNA测序证实筛选得到了LuxS基因缺失的突变株,并且突变株不能诱导V.harveyi BB170的生物发光.与变异链球菌标准菌株相比,LuxS基因突变株的生长情况随着pH的降低受到明显抑制.结论 本研究成功构建LuxS基因缺失的变异链球菌突变株,LuxS感应信号系统参与变异链球菌耐酸能力的调控,LuxS基因缺失菌株耐酸能力降低.
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luxS基因缺失对变异链球菌氧化应激的影响及机制初探
目的 探讨luxS基因缺失对变异链球菌氧化应激的影响及可能机制.方法 变异链球菌标准株和luxS基因缺陷株培养至对数中期分成3组,一组作为对照组在普通乳酪消化胨酵母(TPY)培养液中生长,另两组作为实验组,其中一组加入过氧化氢终浓度58.8 mmol/L的TPY培养液中,另一组加入含有铁螯合剂2,2'-联吡啶的过氧化氢终浓度为58.8 mmol/L的TPY培养液中.分别在厌氧培养的0.5、1、2h取菌液采用平板活菌计数法测定活菌数,计算生存率,统计学分析.结果 和对照组相比,实验组中luxS基因缺陷株的生存率在所测定的时间点均高于标准株(P＜0.05)；与不含铁螯合剂的实验组相比,铁螯合剂的加入并未提高菌株的过氧化氢耐受力(P＞0.05).结论 luxS基因参与变异链球菌氧化应激耐受的调节；该氧化应激耐受并不是通过避免芬顿反应(Fenton reaction)毒性作用实现的.
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LuxS基因缺失的变形链球菌突变株的构建及鉴定
目的 通过同源重组法构建LuxS基因缺失的变形链球菌(Streptococcus mutans)突变株.方法 运用基因同源重组方法将红霉素抗性基因(Eymr)连接到PCR扩增LuxS基因两端区域产生的2个基因片段之间,并共同插入到pUCl9载体的多克隆位点中,构建出带红霉素抗性标志的缺失突变载体pUCluxKO.将突变载体转化到含完整LuxS基因的突变受体变形链球菌标准株中,红霉素筛选出LuxS基因缺失的变形链球菌突变株,并经PCR、生物荧光检测及DNA测序鉴定.结果 构建的突变载体经限制性内切核酸酶酶切分析显示,产生的条带与设计结果完全一致.PCR方法扩增突变株LuxS和Eymr基因显示,LuxS基因已被完整敲除掉,经生物荧光检测,突变株不能诱导哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BBl70的生物发光,说明不能产生信号分子AI-2(autoinducer-2).DNA测序证实筛选得到了LuxS基因缺失的变形链球菌突变株.连续传代培养后证实,变形链球菌LuxS基因突变株具有良好的稳定性.结论 成功构建出LuxS基因缺失的变形链球菌突变株,为研究LuxS基因对变形链球菌致龋毒力的影响奠定了基础.
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变异链球菌luxS基因缺陷突变株生物学性状的初步观察
目的 为研究口腔主要致龋菌变异链球菌的种属间密度感应(quorum sensing)相关基因luxS对口腔生态的影响,构建此菌的luxS基因缺失突变株.方法 采用同源重组的方法,利用红霉素耐药基因erm置换变异链球菌基因组中的luxS基因,并在含抗性标记的选择性培养基上筛选出阳性克隆.初步研究该基因的缺失突变对变异链球菌在生长与生物被膜成熟分化中的作用.结果经PCR鉴定,luxS基因的置换突变位置正确,并能在体外稳定传代,突变株与野生株相比在达静止期后总菌数量上有明显差别,但在生物被膜的形成与分化上并未发现显著差异.结论 通过此研究建立了可稳定传代的变异链球菌luxS基因的缺失突变株,生长表型和生物被膜的形成与野生株无显著差异,为进一步研究此基因功能与调控机制提供了技术平台.
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牙髓卟啉单胞菌密度感应系统luxS基因的克隆及测序
目的 检测牙髓卟啉单胞菌模式株、临床分离株密度感应系统luxS基因.方法 选取牙髓卟啉单胞菌模式株及临床分离株作为研究对象,提取细菌基因组DNA,PCR克隆及测序,并通过基因序列比对,比较临床分离株和模式株的一致性.结果 电泳鉴定存在目的条带,克隆测序和序列比对表明,牙髓卟啉单胞菌PCR产物与目的基因完全一致(均为100％).结论 本实验引物设计合理,能较好地扩增出牙髓卟啉单胞菌的luxS基因,并对其进行测序,为进一步研究牙髓卟啉单胞菌luxS基因的功能奠定基础.
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变形链球菌luxS基因缺失对生物膜早期形成的影响
目的 利用变形链球菌luxS基因敲除突变株,研究这一种属间密度感应系统对生物膜早期形成的影响.方法通过在生物膜培养悬液中加入与菌细胞直径相近的磁性小珠,利用这些小珠在磁场中受到生物膜的位移约束力的原理,采用生物膜定量分析仪,定量比较、分析变形链球菌luxS基因knockout突变株与野生株在生物膜形成上的差异.结果变形链球菌luxS基因突变株与野生株在生物膜形成模式上有显著差别,突变株生物膜自第6小时起开始形成,生物膜形成指数(biofilm index,BFI)差值ABFI=2.015,约第10小时突变株形成的生物膜可完全限制磁珠在磁场中的位移(ABFI=7.025);而野生株生物膜约第10小时开始形成(ABFI=1.875),明显晚于突变株.12h后两菌株生物膜形成未见明显差异(P>0.05).结论变形链球菌luxS基因的缺失可影响生物膜的早期形成.
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粪肠球菌群体感应系统luxS基因的研究
目的 研究粪肠球菌群体感应系统luxS基因的功能并体外合成AI-2信号分子,为研究粪肠球菌LuxS/AI-2依赖的群体感应系统提供依据.方法 以哈氏弧菌BB170作为报告菌株,检测3株粪肠球菌培养上清的AI-2活性,然后从粪肠球菌中扩增出luxS和pfs基因,测序和比对氨基酸序列,并将两基因插入到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中实现表达与纯化,进而以S-腺苷高半胱氨酸为底物、纯化的蛋白或构建的大肠杆菌菌体蛋白为反应酶,体外合成AI-2.结果 3株粪肠球菌均能够分泌有活性的AI-2信号分子;LuxS蛋白序列分析发现其与哈氏弧菌、沙门菌、大肠杆菌具有高度同源性;SAH均可以与纯化的蛋白或构建的大肠杆菌菌体蛋白合成出有活性的AI-2分子.结论 粪肠球菌存在LuxS/AI-2依赖的群体感应系统,AI-2的产生依赖于luxS基因.
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变异链球菌LuxS基因突变株生物被膜结构的电镜观察
目的:探讨变异链球菌Ingbritt C(血清C型)国际标准株与LuxS基因缺失的变异链球菌突变株之间生物被膜的形成差异.方法:分别将变异链球菌标准株和LuxS基因突变株接种于含有2%葡萄糖、2%蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中,以牙釉质磨片为载体,于扫描电镜下观察形成24h的上述两菌株生物被膜.结果:(1)当以葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌标准株和LuxS基因突变株所形成的生物被膜表现型未见明显差异;(2)当以蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物被膜有明显的不同,标准株生物被膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株的生物被膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落;(3)加入标准株的无菌体上清液可以使LuxS基因突变株的生物被膜表型部分恢复正常,提高LuxS基因突变株形成生物被膜的能力.结论:变异链球菌标准株和LuxS基因突变株均能形成生物被膜,但LuxS基因突变株的生物被膜结构发生改变;依赖于LuxS的群体感应系统会影响变异链球菌生物被膜的形成.
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变形链球菌LuxS基因缺陷株生物膜结构的初步观察
生物膜是一种基质包裹的相互黏附或附着于体表及界面的细菌群体,牙菌斑就是一种典型的口腔生物膜,与龋病、牙周病的发生密切相关.
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变形链球菌LuxS基因缺失株对生物膜结构影响的研究
目的：研究变形链球菌标准株和LuxS基因缺失菌株变形链球菌在离体模型上生物膜形成的差异变化情况。方法收集临床上因正畸而拔除的前磨牙或无龋坏的第三磨牙，行菌株复苏增菌及变形链球菌鉴定，后将标本置于扫描电镜下观察。结果变形链球菌标准菌株和LuxS基因缺失菌株在24 h形成的生物膜有明显差异，经观察发现LuxS基因缺失菌株较标准菌稀疏。结论口腔变形链球菌可通过LuxS基因介导的菌种密度感应信号来影响口腔生物膜的形成。
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粪肠球菌luxS基因缺陷菌株的构建
目的:通过同源重组方法构建粪肠球菌密度感应调控基因luxS基因缺陷突变菌株.方法:利用PCR扩增粪肠球菌luxS基因的上、下游片段(up、dn)和红霉素抗性基因片段(erm),依次采用相应的双酶切反应,将这些片段连接入载体pUC18,以构建目的质粒Puemrd重组载体.采用同源重组方法,将红霉素耐药基因erm置换粪肠球菌基因组中的luxS基因,并在含抗性标记的选择性培养基中筛选出阳性克隆.结果:经酶切鉴定,目的质粒各片段插入无误,插入片段的测序报告也显示碱基无错配,成功构建粪肠球菌luxS基因缺陷株.结论:本研究成功构建的粪肠球菌luxS基因突变株,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制提供了技术平台.
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变异链球菌luxS基因对多糖基质代谢的影响
目的:利用变异链球菌luxS基因敲除的突变株,研究该基困缺陷对于生物膜多糖基质的影响.方法:通过向生物膜培养悬液中加入与细菌直径相近的磁性小珠,利用这些小珠由于生物膜约束而在磁场中位移受限的原理,采用生物膜定量分析仪,定量比较luxS突变株与野生株在利用外源性碳水化合物合成生物膜多糖基质能力方面的差异.采用SPSS 10.0软件包对实验数据,进行Dunnet双侧t检验.结果:变异链球菌luxS基因突变株与野生株均可利用碳水化合物合成胞外多糖基质,且外源性糖的加入可显著促进生物膜的形成.在加入1%蔗糖时,2菌株生物膜均在1h内迅速形成,而两者之间无显著差异.在加入1%葡萄糖时,两菌株的生物膜形成速度均有所加快,突变株的改变则更为明显.结论:luxS基因参与调节细菌对多糖基质代谢的过程,而其对于生物膜形成的影响也更多是通过调节多糖基质代谢实现的.
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luxS基因在变异链球菌铁代谢中的作用研究
目的 探讨luxS基因在变异链球菌铁代谢中的作用.方法 在不同铁限制条件培养基中对培养24 h的变异链球菌标准株和缺陷株进行吸光度(A)值的测定和分析；并对luxS基因缺陷株在铁限制培养基中加入外源性铁或者标准株无菌上清液的生长进行A值的测定和进一步分析.结果 培养24 h,2种菌株在螯合剂浓度为0.1 mmol/L的培养基中均未表现明显生长抑制(P＞0.05),在螯合剂浓度增大至0.3 mmol/L时,缺陷株表现出生长抑制(P＜0.05),在螯合剂浓度至0.5 mmol/L时,生长抑制更为显著(P＜0.001).在铁限制培养基中生长抑制的缺陷株转移至新鲜培养基、外源性铁或标准株上清液加入的同浓度铁限制培养基中培养24 h,缺陷株的生长均能达到较高细胞密度(P＜0.05).结论 luxS基因在变异链球菌生长中具有铁代谢作用,其可能通过AI-2部分调节变异链球菌铁限制条件下的生长.
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鼻渊舒口服液对慢性鼻-鼻窦炎患者鼻腔表皮葡萄球菌细菌生物膜形成的影响
目的 探讨鼻渊舒口服液对慢性鼻-鼻窦炎(CRS)患者表皮葡萄球菌细菌生物膜形成及其调控因子的影响.方法采集72名CRS患者及20名正常人窦口鼻道复合体处分泌物,鉴定并分离鼻腔优势菌种表皮葡萄球菌,比较鼻渊舒口服液治疗CRS前后表皮葡萄球菌细菌生物膜形成情况.同时,BB170法检测细菌生物膜种间信号AI-2活性变化,RT-PCR法分析治疗前后luxS转录水平情况.结果正常人及CRS患者治疗前后鼻腔优势菌种均以表皮葡萄球菌为主.正常人鼻腔表皮葡萄球菌细菌生物膜形成率为33％,CRS患者为73％,治疗后患者鼻腔优势表皮葡萄球菌细菌生物膜形成率为41％;治疗后细菌生物膜信号AI-2活性降低,持续时间短;治疗后比治疗前luxS转录水平降低.结论鼻渊舒口服液通过降低luxS转录水平及AI-2活性等多种途径,降低细菌生物膜形成,改善CRS患者鼻腔微环境.
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不同表型表皮葡萄球菌之间的相互作用及LuxS基因对生物膜形成的影响
目的探讨不同表型的表皮葡萄球菌( SE)之间的相互作用机制以及luxS基因在SE形成生物膜过程中所起的作用。方法分别应用 TSB培养液、ATCC12228上清液以及ATCC35984上清液培养产生生物膜的 SE 标准菌株ATCC35984和不产生生物膜的ATCC12228菌株,并采用半定量法检测细菌间多糖黏附素( PIA)以及半定量PCR法检测LuxS基因在该菌株中的表达。结果在TSB培养液中, ATCC35984菌株能形成致密完整的生物膜,而 ATCC12228菌株不能产生生物膜。在ATCC35984上清液中,ATCC12228菌株形成生物膜的能力增强, LuxS 基因表达降低。在ATCC12228菌株上清液中, ATCC35984产生生物膜能力下降,LuxS基因表达增强,两者比较差异均有统计学意义( P<0.05)。结论LuxS基因在SE形成生物膜的过程中起一定作用,并且不同表型的SE之间存在相互影响的现象。
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多药耐药草绿色链球菌LuxS基因同源重组质粒的构建
目的:构建一个含有红霉素抗性基因和多药耐药草绿色链球菌LuxS基因上下游区同源序列的重组质粒,为后续进行LuxS基因敲除实验做准备.方法:设计合成引物,分别以质粒PMG36E、草绿色链球菌DNA为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增得到红霉素抗性基因DNA片断和LuxS基因上下游序列,经双酶切反应插入pUC19质粒的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,氨苄青霉和红霉素培养基筛选.结果:红霉素抗性基因和LuxS基因两侧同源序列成功连入到Puc19质粒相应酶切位点,PCR凝胶电泳、测序结果正确.结论:成功构建多药耐药草绿色链球菌LuxS基因敲除同源重组质粒,为进一步构建LuxS突变株打下基础.
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luxS/AI-2密度感应对缓症链球菌生物膜致病力的影响
目的 了解luxS基因敲除,自体诱导物-2(AI-2)密度感应信号缺失对缓症链球菌生物膜致病力表型的影响.方法 常规细菌培养、药敏试验、形态学与生化反应鉴定,16S核糖体DNA(rDNA)序列同源性分析,获得耐药性缓症链球菌临床分离株.同源重组法敲除luxS基因,构建突变株.哈氏弧菌BB170菌株生物发光实验检测AI-2信号;定量分析临床分离株与突变株生物膜形成量与抗菌药敏感性的差异;荧光黄染液、18909荧光增白染液、L7012死/活菌染液染色,激光共聚焦显微镜扫描,了解生物膜结构、胞外多糖、死/活菌分布差异;临床分离株上清液、4,5-二羟基-2,3-戊二酮(DPD)补偿生长实验确认突变株表型改变的原因.实验数据行KolmogorovSmimo非参数检验.结果 luxS基因突变株与临床分离株生物膜形成量存在显著性差异(P＜0.001);氨苄西林、环丙沙星、四环素干预条件下,突变株生物膜形成量显著降低.上清液、DPD补偿后,突变株生物膜形成能力和结构可以恢复.突变株生物膜结构变疏松,对氨苄西林、环内沙星、四环素的敏感性增加.结论 luxS/AI-2密度感应信号缺失,导致耐药性缓症链球菌生物膜形成量下降,抗菌药敏感性增加,致病力表型发生改变.
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口腔链球菌密度感应信号系统comE基因及luxS基因的检测分析
目的 检测口腔链球菌密度感应系统中的2个重要基因comE以及luxS.方法 选取口腔链球菌临床分离株NH521为研究对象,提取基因组DNA,通过聚合酶链式反应进行电泳鉴定和DNA测序,并与GenBank数据库中相关序列进行比较分析.结果 电泳鉴定表明口腔链球菌NH521存在comE和LuxS基因.所测序列与GenBank相关序列比较分析表明:luxS、comE基因在口腔链球菌种内不同株系间的DNA序列一致度分别为95.0%和99.6%;对比口腔链球菌与变异链球菌,luxS和comE基因的DNA序列一致度分别为74.1%和12.7%.结论 口腔链球菌NH521中存在comE和luxS基因序列,并且luxS基因在种内不同株系间比comE基因积累了更多变异,而comE基因在不同链球菌物种间却更加分化.
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变形链球菌luxS基因同源重组克隆载体的构建实验
目的构建luxS基因的同源重组克隆载体以备将来进行luxS基因同源重组knockout突变株的研究.方法利用高保真的pfu DNA聚合酶,通过嵌套式PCR的方法,分别扩增出变形链球菌luxS基因的上下游片段(Xup,Xdn)以及大肠杆菌pH 1+质粒的卡那霉素抗性基因片段(Kana),依次采用相应的双酶切反应将这些片段连接入噬菌体载体pBluescriptRSK(+)Phagemids,以构建目的质粒Xukd-pbsk重组载体.结果经酶切鉴定目的质粒各片段插入无误,插入片段的测序报告也显示碱基无错配,含目的质粒的菌株可在含30 mg/L卡那霉素的LB培养基内生长良好,证明插入的卡那霉素抗性基因体外表达良好.结论本研究构建的变形链球菌luxS基因同源重组克隆载体正确,可用于今后对于变形链球菌luxS基因突变株构建的研究.
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阿奇霉素联合亚胺培南对肺炎克雷伯菌生物膜的抑制作用
目的 研究阿奇霉素(azithromycin,AZM)联合亚胺培南(imipenem,IPM)对肺炎克雷伯菌生物膜(biofilm,BF)的抑制作用.方法 采用改良平板法建立肺炎克雷伯菌BF模型,微量稀释法测定抗菌药物的低抑菌浓度,银染法快速鉴定细菌BF,噻唑蓝(MTT)比色法测定BF中的活菌数,棋盘设计法测定阿奇霉素和亚胺培南对BF的协同抑制作用,用RT-PCR对联合用药前后luxS基因的表达进行相对定量分析,检测结果采用SPSS13.0软件进行统计处理.结果 加入1/16、1/4MIC阿奇霉素可显著增加1/4、1/2及1MIC亚胺培南对肺炎克雷伯菌BF的抑菌活性;加入1/4、1/2及1MIC的亚胺培南也可显著增加1/16、1/4MIC阿奇霉素的抑菌活性;1MIC IPM与1/4、1/16MIC AZM联合应用;1/2MIC IPM与1/4MIC AZM联合应用可以下调luxS基因的表达.结论 阿奇霉素与亚胺培南联合使用可下调肺炎克雷伯菌luxS基因的表达,从而增强其对BF的抑菌活性.
