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浙江省产超广谱β-内酰胺酶菌株SHV型β-内酰胺酶分布
随着三代头孢菌素如头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松和单环酰胺类抗生素在临床上的广泛使用,超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)在革兰阴性杆菌中产生率不断增加,ESBLs种类也不断增加,至2000年6月,已发现近100种ESBLs亚型[1],其中TEM型有67种,SHV型有24种,非TEM非SHV型有20多种.TEM和SHV型分别由广谱酶TEM-1、TEM-2和SHV-1编码基因中1～5个位点发生点突变而来.各国各地区流行的ESBLs亚型各不相同[2].我们对浙江省各地区临床分离的表型鉴定为产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌SHV型β-内酰胺酶编码基因进行克隆、序列分析和亚型鉴定,结果如下.
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Veenhuisii毛孢子菌的生物学特性研究
目的：探讨自ICU患者的肺泡灌洗液分离到的12株Veenhuisii毛孢子菌的真菌学特征，并对其进行表型鉴定、分子生物学鉴定和抗真菌药物敏感性试验。方法采用患者的肺泡灌洗液标本进行分离培养后，进行常规真菌学鉴定和菌株的ITS区序列测定，以及采用CLSI制定的酵母菌液基稀释法对12株菌株进行体外两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑5种抗真菌药物敏感性试验。结果12株毛孢子菌经真菌学表型鉴定为阿萨希毛孢子菌；但ITS区序列测定为Veenhuisii毛孢子菌，体外5种抗真菌药物敏感性试验结果显示，12株Veenhuisii毛孢子菌对两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑均敏感。结论 Veenhuisii毛孢子菌在人体标本中分离到为我国首次报道，在对其进行的真菌学鉴定中，常规的表型鉴定方法不足以准确鉴定结果，应进行 rDNA基因序列检测证实。
关键词： Veenhuisii毛孢子菌 表型鉴定 ITS区序列测定 -
基质辅助激光解析离子-飞行时间质谱仪在快速鉴定凝固酶阴性葡萄球菌中的应用
目的 评价基质辅助激光解析离子-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS,MS)在临床分离凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)快速鉴定中的应用.方法 收集复旦大学附属中山医院2012年7月-2013年1月分离自血液的194株CNS;分别使用MS和全自动细菌鉴定系统(细菌鉴定仪)鉴定到种,当两种方法结果不一致时使用16S rRNA测序方法进行确认,比较两种鉴定方法的符合率及准确性,评价MS使用价值.结果 194株CNS中148株两种方法鉴定结果一致,符合率76.3％,以16S rRNA方法为金标准,MS和细菌鉴定仪与16S rRNA的结果假定符合率分别为98.9％和76.3％,两种方法准确性差异有统计学意义(P＜0.001).结论 MS用于鉴定CNS比传统方法快速、准确和价廉.
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酸性微环境对舌鳞癌中单核/巨噬细胞表型影响的实验研究
目的 以舌鳞癌为研究对象,研究探讨肿瘤组织酸性微环境对单核/巨噬细胞的表型变化和功能的影响.方法 采用密度梯度离心法从健康人的外周血分离单核/巨噬细胞;从中国科学院细胞库购买人舌鳞癌细胞株(Tca-8113),将两种细胞分别在酸性微环境(pH6.5/6.8/7.0)和常规环境下(pH7.2)单独及混合培养,以常规环境下培养作为对照,4h后ELISA检测细胞培养上清液中Arg和iNOS的水平变化.结果 在酸性微环境下,单核/巨噬细胞单独培养和与舌鳞癌细胞混合培养的iNOS分泌明显减少和Arg分泌明显增加,均高于常规环境下单核/巨噬细胞单独培养和与舌鳞癌细胞混合培养,两者差异有统计学意义(P<0.05);在酸性微环境及常规环境中,舌鳞癌细胞单独培养上清液中,Arg和iNOS无明显变化,两者差异无统计学意义(P>0.05).结论 舌鳞癌酸性微环境中单核/巨噬细胞的表型偏向于M2型,即单核/巨噬细胞在舌癌酸性环境中可能通过自身表型的变化,分泌细胞因子下调免疫应答,参与了肿瘤的的生长、侵袭和转移等.
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16SrRNA基因序列分析鉴定小分子抗菌肽产生菌株HD1.7
乳酸菌是一类发酵糖产生大量乳酸的兼性厌氧菌,广泛应用于医药、食品及发酵工业,该菌除了产生乳酸外,还可以产生一些有抑菌或杀菌作用的物质.乳酸链菌肽就是乳链球菌代谢产生的小分子抗菌肽,目前被世界上50多个国家和地区应用为食品的天然防腐剂.我们在进行L-乳酸菌应用研究过程中从酸菜发酵汁中分离到了能产生抑菌物质的菌株HD1.7,并对该菌株进行了系统的表型鉴定,初步确定为乳酸杆菌.
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乙醛脱氢酶活性检测子宫内膜干细胞
背景:人子宫内膜中存在干细胞特性的细胞,但特异性标志物尚未找到,导致此类细胞很难被分离.目的:分析乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)活性检测能否分选出子宫内膜干细胞.方法:采用机械和酶消化相结合方法分离人子宫内膜细胞,用两次滤网方法分离出基质细胞和上皮细胞,根据乙醛脱氢酶活性采用流式细胞仪分选出ALDHhigh细胞和ALDHlow细胞,用有限稀释法培养细胞,观察细胞形态及生长特性;采用流式细胞仪鉴定细胞c-kit,CD90,CD73 及CD29 的表达.结果与结论:基质细胞中ALDH high细胞占(1.88±0.17)%,经过15 d的原代培养后,ALDHlow细胞克隆形成率达(1.06±0.34)%,ALDHhigh细胞克隆形成率达(4.50±0.82)%,ALDHhigh细胞集落形成率较ALDHlow细胞高(P< 0.05),同时ALDHhigh细胞大克隆数较ALDHlow高(P < 0.05) ;上皮细胞中未发现ALDHhigh细胞及克隆形成.子宫内膜集落形成细胞表现出c-kit、CD29、CD90、CD73 阳性.说明ALDH活性检测对子宫内膜干细胞有一定的分选作用.
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幼兔髂骨穿刺抽取骨髓间充质干细胞分离培养鉴定：注意的细节与技术
背景：骨髓间充质干细胞被认为是构建组织工程骨修复骨与软骨缺损中较为常用的种子细胞，在其基本操作过程中注意常见问题并及时避免，对后期细胞学及组织工程学实验很有意义。目的：通过作者实验操作过程中所遇问题的总结和分析，为初学者和科研人员提供可靠的骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法，减少操作过程中的人为失误和易犯问题。方法：取16只幼年新西兰大白兔作为实验对象，进行髂骨穿刺抽取骨髓液。采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外筛选纯化细胞，并且通过倒置相差显微镜观察其形态学特点、生长曲线和流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞表型。结果与结论：实验过程中前5只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离过程中遇到不同的问题和困难，经认真总结和分析，后11只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离均获成功，在细胞培养过程中未发现细菌污染和细胞老化，第3代骨髓间充质干细胞高表达CD29、CD44抗原，而CD14、CD34抗原低表达，MTT测细胞生长曲线显示P3和P5增殖活性较高。尽管骨髓间充质干细胞分离培养鉴定技术已较为成熟，但是如果操作过程中不注意细节问题，也将会导致实验困难重重或失败。严格执行常规操作步骤可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞，提高成功率，为后续相关细胞实验和动物实验做好准备。
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利用月经血建立的经血源性基质干细胞系
背景：经血源性基质干细胞被证实是一种新型的成体干细胞，目前国内关于其系统的建系方法报道极少。
目的：建立经血源性基质干细胞系，并鉴定其表型和多能性。
方法：收集健康成年女性的月经血，通过密度梯度离心法分离出经血源性基质干细胞进行培养，观察细胞的形态及增殖特性；采用CCK-8法检测各株细胞的增殖能力，定期收集细胞进行核型分析，采用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34，CD38，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105，Oct-4的表达，对细胞进行体外成脂和成骨诱导分化并鉴定。
结果与结论：成功从6名健康志愿者的经血中分离获得4株经血源性基质干细胞系。细胞呈现典型的梭状结构，具有46，XX核型，能在体外稳定迅速增殖，传代后大约48 h进入对数生长期，表达CD44，CD73， CD90，CD105及Oct-4，不表达CD38，CD34，CD45；成脂诱导22 d后油红O染色阳性，成骨诱导2周后茜素红染色阳性。实验表明经血源性基质干细胞具备扩增迅速、核型稳定、多潜能性等优点，通过建立经血源性基质干细胞系，为进一步的临床治疗应用以及科学研究奠定了基础。 -
分枝杆菌在北京水源环境中的分布:M.arupense国内首次报告
目的:研究北京水源中分枝杆菌的分布,应用表型鉴定方法和分子生物学方法进行分枝杆菌鉴定,并比较两种方法的准确性和优缺点.方法:采集水源环境标本,进行分枝杆菌分离培养,通过生化反应对所有分离株进行鉴定.同时从培养菌落中提取分枝杆菌DNA,用PCR扩增65 ku热休克蛋白基因,扩增产物分别应用两种限制性内切酶BstEⅡ和Hae Ⅲ酶切,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析和PCR产物的测序分析.结果:从30份养鱼水中分离出35株分枝杆菌.①表型鉴定结果:Runyon Ⅰ群1株,可疑为海分枝杆菌;Runyon Ⅱ群7株,确定为戈登分枝杆菌或疑似戈登分枝杆菌;Runyon Ⅲ群9株,未鉴定到种;Runyon Ⅳ群18株,其中龟-偶发分枝杆菌复合群9株,其余9株未鉴定到种.②PCR-RFLP鉴定结果:戈登分枝杆菌8株,龟-偶发分枝杆菌复合群8株(包括M.peregrinum 1株),疑似日内瓦分枝杆菌10株,其余9株未鉴定到种.③PCR产物测序鉴定:戈登分枝杆菌10株,M.arupense9株,偶发分枝杆菌7株,土分枝杆菌6株,不产色分枝杆菌1株,M.peregrinum 1株,脓肿分枝杆菌1株.结论:非结核分枝杆菌(NTM)广泛存在于养鱼水中,分枝杆菌采用65 ku热休克蛋白基因PCR扩增配合测序鉴定较传统表型鉴定和PCR-RFLP更准确.
关键词： 分枝杆菌 非结核 表型鉴定 M.arupense 限制性片段长度多态性 序列分析 -
对1株疑似鼠疫耶尔森氏菌的系统鉴定
目的 对1株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌).方法 用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征.结果 该菌株具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖(+)、鼠李糖(-)、麦芽糖(+)、蜜二糖(-)、甘油(+)、脱氮(+),与典型鼠疫菌一致.毒力因子检查结果为均为阴性;对实验动物小白鼠完全无致死能力.全基因组芯片杂交实验和PCR扩增表明55023菌株没有鼠疫菌的三个质粒;也不具鼠疫标识基因;pgm位点代表性基因YPO1954扩增阳性,YPO1908扩增阴性,表明其pgm位点不完整;差异片段(DFR)分型结果表明该菌株缺失了14个DFR,不符合鼠疫菌的特征;多位点序列分型(MLST)分析结果表明该菌株与鼠疫存在16个碱基的差异,而与血清III型假结核耶尔森氏菌仅相差两个碱基.结论 尽管55023菌株具备鼠疫菌的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌,而可能是血清III型的假结核耶尔森氏菌;噬菌体裂解结果等表型不能作为鼠疫菌鉴定的终标准.
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利用16S rRNA(DNA)基因建立多种PCR法快速检测拟杆菌
拟杆菌是从人源性患者身上分离出来多的一类厌氧菌.可引起严重的牙周炎、败血症以及伤口感染等,须及时进行抗生素治疗.厌氧菌培养法表型鉴定等,步骤繁琐,细菌之间有些生化试验结果相似,甚至只能依赖1个表型特征鉴别.而且,检测人员判定结果带有一定的主观性.因此,迫切需要准确快速灵敏的方法来改变现状[1].
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猪心脏瓣膜间质细胞培养方法的改进
目的 探讨猪原代心脏瓣膜间质细胞分离培养的简便方法,并进行表型鉴定.方法 取10头实验猪心脏,获取主动脉瓣,实验组采用改进后的Ⅱ型胶原酶一段15 min消化法分离培养间质细胞,对照组采用传统Ⅱ型胶原酶两段90 min消化法分离培养间质细胞.观察同一时间2组间质细胞形态学差异,免疫细胞化学染色法分析间质细胞表型,CCK-8法检测培养1、3、5、7d吸光度值并绘制细胞生长曲线.结果 实验组和对照组分离出的原代瓣膜间质细胞生长方式及形态特点无明显差异;细胞表型鉴定显示2组α-平滑肌肌动蛋白及波形蛋白均阳性;CCK-8检测结果及细胞生长曲线显示,实验组和对照组间质细胞生长趋势基本一致,1～3 d为快速增长期,3～5 d为平台期,5～7 d为缓慢增长期.结论 改进后的原代心脏瓣膜间质细胞分离培养方法操作时间短,为离体条件下行心脏瓣膜病的研究以及体外细胞模型的建立提供了可靠、快速的实验基础.
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新一代测序技术及其在遗传性聋基因研究中的应用
近几年,新一代测序技术(next-generation sequencing technology,NGS)已经被广泛的应用.该技术可以提供高质量和处理数目庞大的测序数据,帮助研究人员深入地理解掌握基因组和转录组,并将深入到医学病理分析、临床诊断、疾病预测、表型鉴定和个体化的治疗等各个领域,极大地推动生物学和生物医学的研究和发展.但是这项技术目前依旧是非常复杂的,为了很好的将其用于生物学和生物医学的研究,需要将分子生物学技术和生物信息学两方面的知识结合.本综述主要介绍新一代测序技术的特点、原理、应用平台和功能及其在耳聋基因研究中的应用和面临的挑战.
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大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定
目的:培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行鉴定,为进一步的研究打基础.方法:分别采用全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,并应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD29、CD90以及CD11b进行表型鉴定.结果:两种方法培养的细胞均为成纤维样细胞,呈集落式生长,全骨髓培养法培养的BMSCs表达CD34-(95.4%),CD44+(94.2%),CD45-(91.6%),CD29+(93.8%),CD90+(98%),CD11b-(87.6%),梯度离心法培养的BMSCs表达CD34-(96.9%),CD44+(97.3%),CD45-(97.5%),CD29+(99.4%),CD90+(99.8%),CD11b-(96%).结论:两种方法均可分离培养出较纯化的BMSCs,但全骨髓贴壁培养法简单易行,原代培养周期较短.
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聚合酶链反应技术在感染性疾病诊断中的应用
在感染性疾病诊断中,病原微生物检出阳性率对其有重要影响.病原微生物常规检测方法,主要是针对目的微生物的培养特性、生化反应、抗原特异性及噬菌体敏感性等表型特征进行分析,但由于表型特征的相对不稳定性以及表型鉴定耗时较长等原因,人们一直在探索更可靠、更快捷、更敏感的微生物检测技术.聚合酶链反应(polymerase chaireaction,PCR)技术作为一种以体外核酸扩增为基础的经典分子生物学技术[1],为某些感染性疾病的早期病原学确认提供了有效帮助,现已成为感染性疾病诊断中不可或缺的手段.
