含人HSP72重组腺病毒制备及其在肠上皮细胞中的表达

目的:构建并鉴定含人全长热休克蛋白72(HSP72)基因的重组腺病毒,为严重创伤后缺血缺氧损伤的防治提供基因治疗措施.方法:用同源重组方法构建含人全长HSP72目的基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-HSP72),并加以鉴定、扩增,以制取高滴度AdCMV-HSP72转染液,体外转染肠上皮细胞株IEC-6,检测目的基因表达.结果:将构建的重组腺病毒载体AdCMV-HSP72转染肠上皮细胞并表达48 h后,RT-PCR检测转染组显示特异性扩增的532bpHSP72目的基因片段.对照组(转染空腺病毒载体组)扩增结果为阴性.蛋白印迹结果显示AdCMV-HSP72转染组HSP72蛋白的表达明显增高.结论:腺病毒载体可较高效率介导HSP72在肠上皮细胞的表达.所获AdCMV-HSP72重组腺病毒可进一步用于基因治疗研究.

贮脂细胞Smad4反义基因转移及对细胞外基质合成的抑制作用

目的:探讨通过反义Smad4基因转移阻断TGF-β1的信号传导后对贮脂细胞激活和细胞外基质产生的影响.方法:将Smad4的基因序列反向插入腺病毒表达质粒pAdv5SR(+),构建反义Smad4的表达质粒pAdAT Smad4.该表达载体再与重组质粒pJM17同源重组,共转染入293细胞,通过PCR法筛选、鉴定,得到含反义Smad4基因的复制缺陷型重组腺病毒AdAT Smad4.将AdATSmad4扩增纯化,再转入贮脂细胞株CFSC内,应用RT-PCR检测反义基因的表达,用原位杂交和免疫组织化学等方法检测Smad4和细胞外基质的产生.结果:转基因的CFSC细胞内有反义Smad4表达,且其合成分泌Smad4和细胞外基质降低.结论:反义Smad4 RNA可以抑制贮脂细胞的激活和内源性Smad4和细胞外基质的产生,为抗纤维化基因治疗提供理论依据.

重组复制缺陷型腺病毒基因治疗肝纤维化的研究与应用

肝纤维化的特征性变化是肝内细胞外基质的过多沉积.抑制肝星形细胞的激活和细胞外基质的合成,促进基质降解和肝细胞再生是肝纤维化治疗的重要方法.近年来,针对上述环节构建重组复制缺陷型腺病毒,表达不同外源基因产物基因治疗肝纤维化研究取得了较大的进展.本文对重组腺病毒的结构、构建以及抗肝纤维化作用和安全性研究作一综述.

野生型P53基因对肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响

目的:观察野生型p53基因对昆明鼠肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响,探讨p53基因的抑瘤机制.方法:♂5周龄昆明鼠30只,随机分类肝癌组(Ⅰ)和p53基因治疗组(Ⅱ).每只鼠于后肢股部皮下接种Hep-A-22肝癌细胞悬液0.2 mL,建立动物模型.接种后24 h,Ⅱ组实验动物于荷瘤局部皮下注射介导野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒液0.2 mL,14 d后处死实验动物.PCR-ELISA定量检测肝癌组织端粒酶活性,免疫组化观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达情况.结果:腺病毒介导的野生型p53基因能够显著抱制肝癌的生长(肿瘤直径23.32±1.45 cm vs5.13±0.37 cm,P＜0.001),明显降低端粒酶的活性表达(A值2.46±0.35vs0.78±0.06,P＜0.01),下调Bcl-2基因蛋白的生成(表达阳性率67.8%vs 25.9%,P＜0.05).结论:野生型p53基因从抑制肝瘤细胞增生,促进肿瘤细胞凋亡两个方面发挥抑癌功能.

血管内皮生长因子反义核酸治疗裸鼠皮下种植胰腺癌

目的:探讨抗血管生成基因转染治疗胰腺癌的可行性.方法:构建反向插入VEGF165cDNA的复制缺陷型腺病毒载体,体外转染SW1990细胞,MTT法检测重组腺病毒转染对细胞生长的影响.Northern blot和ELISA检测转染前后SW1990细胞VEGF的mRNA水平和蛋白表达.裸鼠皮下种植瘤瘤体内注射重组腺病毒,CD31染色观察反义VEGF重组腺病毒转染对裸鼠种植瘤微血管密度和肿瘤生长速度的影响.结果:重组腺病毒体外转染并不影响SW1990细胞的生长速度.Northern blot和ELISA检测在mRNA水平和蛋白水平证实反义VEGF重组腺病毒转染对体外培养的SW1990细胞内源性VEGF表达有明显的下调作用.体内实验表明反义VEGF重组腺病毒转染可减少肿瘤内微血管数量,肿瘤生长受到抑制.结论:反义VEGF165重组腺病毒可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤的生长,为抗血管生成的基因治疗奠定了基础.

复制缺陷型HCV C基因腺病毒表达载体的构建包装及鉴定

目的:构建能表达HCV C基因的复制缺陷型腺病毒表达载体.方法:将HCV H株C区基因定向插入到腺病毒穿梭质粒pAd.CMV-Link.1中,获得重组质粒pAd.HCV-C,再与pJM1 7共转染293细胞,包装腺病毒表达载体.通过酶切、PCR及测序对穿梭质粒进行了鉴定.对腺病毒载体进行了感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.利用间接免疫荧光法和Western blot检测了腺病毒载体在人肝癌细胞HepG2中的表达.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HCV C区基因.包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HCV C区基因,并可以在HepG2细胞中表达HCV C抗原.结论:包装成功的复制缺陷型腺病毒载体可以在HepG2细胞中表达HCV C抗原,为丙型肝炎的基因治疗及疫苗的进一步研究奠定了基础.

抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasv-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd-ScFv,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒Ad-ScFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达.结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.

人血管生成素-1和血管内皮生长因子165基因克隆及复制缺陷型腺病毒载体构建

本研究克隆人血管生成素-1(Angiopoietin-1, Ang1)和血管内皮生长因子(VEGF)165的全长编码基因,构建高转染效率和表达水平的复制缺陷型腺病毒重组体.研究结果显示,Ang1和VEGF联合应用具有抗细胞凋亡的作用.

蜂毒素基因重组腺病毒转染对肝癌细胞周期及磷脂酶A2表达的影响

蜂毒素(Melittin, Mel)是一种动物毒素,具有显著的抗肿瘤作用[1],但其溶血副作用限制了临床应用.为达到减毒增效的目的,将编码蜂毒素的基因置于人甲胎蛋白(AFP)基因启动子后,以复制缺陷型腺病毒为载体构建重组腺病毒.在初步证实该重组腺病毒对AFP阳性肝癌细胞具有特异性杀伤作用的基础上[2,3],通过观察其对肝癌细胞周期及磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2)表达的影响,探讨其作用机制.

重组复制缺陷型腺病毒载体介导bFGF基因治疗大鼠缺血皮瓣的实验研究

近年来生长因子转基因在治疗皮瓣远端缺血领域表现出广阔的前景,我们的实验旨在探讨局部应用以重组复制缺陷型腺病毒为载体的碱性成纤维细胞生长因子(Ad-bFGF)基因治疗,对大鼠缺血皮瓣生存的影响.

表达狂犬病毒糖蛋白基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其特性

目的构建表达狂犬病毒CVS-N2C毒株糖蛋白(GP)基因的复制缺陷型重组腺病毒,作为筛选狂犬病毒基因工程疫苗的基础.方法用大肠杆菌细胞内同源重组技术构建重组病毒;Notrhern blot,Western blot和免疫荧光抗体等方法鉴定重组病毒.结果重组病毒具有典型的病毒形态;病毒基因组稳定;GP基因可被转录;重组病毒表达的GP蛋白相对分子质量为66 000,与天然GP相对分子质量相符;表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒免疫血清特异性识别;小鼠免疫-攻击试验可保护87.5%～100%动物.结论成功地构建了表达狂犬病毒CVS-N2C毒株GP基因的复制缺陷型重组腺病毒,并表现了良好的免疫效果.

新IκBα突变体基因转染对人外周血来源的树突状细胞的作用

哮喘是T细胞介导的嗜酸细胞性气道变应性炎症.作为功能强的抗原递呈细胞,树突状细胞(DC)在T细胞免疫偏移中起关键作用.核因子кB(NF-κB)系p50/p65异源二聚体,IκBα为NF-кB抑制剂(IкB)家族中重要的成员,两者结合以三聚体形式位于静止的细胞质中.IκBα N端丝氨酸(Ser)32/36位点发生磷酸化和降解作用,是NF-κB激活的共同途径.研究表明,NF-κB过度激活是哮喘慢性气道炎症持续和扩大的重要基础[1].近,我们定点克隆了去除N端Ser 32/36磷酸化位点、长801 bp(203-1003 bp)的人胎盘组织IκBα突变体(IκBαM)基因,获得不易降解的新颖NF-κB超强抑制剂,并构建了其复制缺陷型重组腺病毒AdIκBαM [2].本研究观察AdIκBαM对人外周血单核细胞(PBMC)来源的DC凋亡、表型和刺激T细胞增殖作用的影响,探讨DC免疫治疗哮喘的新途径.

重组腺病毒介导的人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因增强原代肝癌细胞的免疫原性

我们以往的研究表明,介导人野生型p53、GM-CSF及B7-1 3个基因的复制缺陷型腺病毒载体BB-102可诱导肝癌细胞的凋亡[1],提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性[2],抑制肝癌细胞的生长.本研究进一步研究BB-102介导的GM-CSF和B7-1基因表达,增强肝癌细胞免疫原性的作用,为临床上应用此载体消除手术后残留的肝癌细胞提供实验依据.

癌基因治疗中的腺病毒载体的开发和应用(综述Ⅲ)

3大容量腺病毒载体的开发3.1新型腺病毒辅助细胞系和相关载体的开发作为复制缺陷型和不依赖于辅助病毒的腺病毒载体系统的一部分,辅助细胞系显得非常重要.一般来说,这个工作是通过把更多的Ad基因或基因组区域放到细胞里来提高反义互补的容量.在这条原则下成功研制的新型Ad载体有如下几点益处,如增加基因携带容量,减少产生RCA的可能性以及减少载体的免疫原性.然而目前的问题是在新的辅助细胞系中按时序为Ad的自然增殖提供互补成分时如何避免病毒蛋白诱导的细胞毒性.

056 复制缺陷型腺病毒疫苗载体诱导有效的抗免疫缺陷病毒免疫

腺病毒-BMP7载体的包装与纯化

腺病毒(Adeno)基因组为线状双链DNA,长度大约36 kb,适合于容纳较大片段外源基因.与逆转录病毒载体相比,腺病毒载体能有效地将外源基因转染到各种靶细胞中.其宿主范围广,感染性强,尤其能感染分化后的非分裂期细胞.在Adeno生活周期中,其基因不整合到宿主细胞DNA中,故无插入突变激活癌基因的危险,外源基因能游离地表达.商品化的腺病毒载体一般剔除了其基因组的E1区,经体外重组后,产生可复制缺陷型腺病毒.再经过293细胞的包装过程,得到具有感染能力的腺病毒用以转染靶细胞.2002年,我室构建了腺病毒-BMP7(简称AV-BMP7)表达载体,用于组织工程化骨的修复实验,取得实效.现将该病毒包装、纯化技术分述如下.

复制型腺病毒的研究进展

腺病毒作为肿瘤治疗手段的应用早可以追溯到上个世纪的50年代,但当时利用野生型腺病毒对30个临床病人的治疗并未获得可靠的治疗效果,因此很快研究被终止.随后的研究发展出复制缺陷型腺病毒载体,用来介导抗肿瘤基因进行肿瘤治疗,这种腺病毒载体具有很多的优越性[1]:1.

抗KDRscFv复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建抗KDRscFv复制缺陷型腺病毒载体,为抗KDRscFv抗肿瘤血管生成的体内应用打下实验基础.方法 采用重叠延伸PCR方法构建IL-2信号肽及抗KDRscFv融合基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含pAdEasy-1的BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗KDRscFv基因(含信号肽)的重组腺病毒载体pAd-抗KDRscFv,经脂质体法转染293细胞.包装产生携带抗KDRscFv基因的重组腺病毒Ad-抗KDRscFv.结果 构建了表达抗KDRscFv基因的复制缺陷型腺病毒,且该重组腺病毒能在肝癌细胞株HepG2中高效表达,结论成功构建表达抗KDRscFv基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究抗KDR-scFv存肿瘤治疗中的作朋研究提供实验基础,,

小鼠白细胞介素-15基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

我们利用转基因技术体外构建表达小鼠白细胞介素-15(mIL-15)基因的复制缺陷型腺病毒载体,为研究mIL-15基因修饰树突状细胞(DC)诱导肿瘤免疫反应奠定基础.

大鼠基因工程化神经干细胞的建立

自从九十年代初科学家们分离、培养出神经干细胞以来,人们相继从各种动物及人的中枢神经系统内分离、培养了神经干细胞,因其具有很强的分裂、增殖及自我更新能力,打破了传统的认为中枢神经系统细胞不能再生的观念,为中枢神经系统损伤修复及某些疾病的治疗带来了新的希望.随着基因工程技术的发展,人们可根据不同的科研及治疗目的,对神经干细胞进行不同的遗传学修饰、以制成基因工程细胞,这些细胞极具科研和应用价值,受到广泛关注.本实验利用无血清培养技术,分离、培养了胚鼠端脑神经干细胞,并用巢素(Nestin)免疫组化染色鉴定;诱导神经干细胞分化,用神经丝-200(NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 免疫组化染色鉴定分化细胞.再用含有脑源性神经营养因子(BDNF)的复制缺陷型腺病毒感染神经干细胞,并用原位杂交检测.结果显示:①获得了大量未分化,呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,且能诱导分化为神经元和神经胶质细胞.②约80-90%神经干细胞能被腺病毒感染,经传代培养12代后仍具干细胞特性.因此,本实验从胚鼠端脑分离培养的细胞具有自我更新能力和多潜能分化能力,为中枢神经系统的干细胞.经基因工程化及传代后 ,仍具干细胞特性,获得了大量基因工程化的神经干细胞,以期为神经干细胞的基础研究和中枢神经损伤修复及疾病治疗提供基础资料.