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腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠成体肝干细胞中的表达
目的:研究腺病毒感染成体肝干细胞介导外源基因表达的可行性及建立稳定表达EGFP的成体肝干细胞.方法:采用细菌同源重组法构建CMW驱动的EGFP报告基因腺病毒载体pAd-CMV-EGFP,在293细胞中包装制备腺病毒,并用重组腺病毒感染体外培养的成体肝干细胞WB-F344,观察腺病毒携带的外源基因EGFP在WB-F344细胞中的表达,及分析病毒对肝干细胞的感染效率.进一步单克隆培养纯化建立稳定表达EGFP的细胞株(WBEGFP),并采用流式细胞技术、免疫细胞化学技术、诱导分化实验以观察其生物学特性.结果:成功构建腺病毒载体,并包装制备高滴度的重组腺病毒Ad-EGFP.重组腺病毒有效的感染WB-F344细胞,感染率约40-70%.建立WB-EGFP细胞株,持续传代8-9代均较稳定表达EGFP及肝干细胞表面标记,仍保持干细胞样的增生、分化等基本生物学特性.结论:腺病毒可高水平的介导外源基因表达于成体肝干细胞,是有效的基因转移系统.稳定表达EGFP的肝干细胞株观察直观、可连续传代,并保持干细胞的生物学特性,可用于体内外肝细胞研究中的追踪、鉴定.
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口腔癌细胞HSV-tk基因的转导及其鉴定
单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-tk)是自杀基因的代表。我们将HSV-tk基因转导入口腔癌细胞系Tca8113和ACC-M细胞并对基因转导细胞进行鉴定，以便为体内外及临床前期试验打下基础。 材料与方法:①人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113和人高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-M由上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科建立［1,2］。逆转录病毒包装细胞PA317细胞、NIH3T3细胞由上海第二医科大学人类基因治疗中心保存。含HSV-tk基因的逆转录病毒载体pL(TK)SN由上海第二医科大学人类基因治疗中心构建。②脂质体介导基因转移: PA317细胞中加入DNA与脂质体混合物1 ml，6 h后，以400 mg/L G418筛选至克隆出现并扩增，命名为PA317TK细胞和PA317LN细胞。③逆转录病毒载体上清液的收集及滴度测定: 收集PA317TK和PA317LN细胞培养上清液。NIH3T3细胞中加入8 mg/L的polybrene和适量病毒悬液，8 h后以G418筛选至克隆出现。根据克隆形成数计算病毒滴度。④肿瘤细胞tk基因的转导：肿瘤细胞中加入polybrene和适量病毒上清液，24 h后，以G418筛选至克隆出现并扩增。⑤PCR鉴定外源基因整合: 细胞总DNA进行PCR：NeoR基因5′端引物为5′-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3′，3′端引物为5′-CCCGCTCAGAAAGAACTCGTC-3′。⑥RT-PCR检测外源基因表达 TRIzol RNA抽提试剂盒抽提细胞RNA并进行RT-PCR，产物做PCR，β-actin作内参照。⑦安全性检测: 1 μg细胞DNA进行PCR：env基因5′端引物为5′-ACCTGGAGAGTCACCAACC-3′，3′端引物为5′-TACTTTGGAGAG GTCGTAGC-3′。
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外源基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
酵母是单细胞真核生物,既具有类似原核生物的生长特性,又具有一般真核生物的细胞生物学特性.巴斯德毕赤酵母是新近发展起来的新型表达系统,许多有应用价值的外源基因成功地在其中表达,使其日益受到关注.本文就毕赤酵母的生物学特性、表达系统的构建和分泌蛋白的翻译后修饰等方面进行综述.
关键词： 外源基因表达 巴斯德毕赤酵母:真核表达系统 AOX1启动子 -
巴斯德毕赤酵母真核蛋白表达系统的研究进展
自1981年hitzeman等[1]首次在酿酒酵母中表达了人重组干扰素基因后,相继又有多种外源基因表达成功.
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hLRH-1调控结肠腺癌细胞SW480增殖的分子机制
目的 初步探讨人核受体hLRH-1在结肠癌发生发展中可能的生物学功能.方法 真核表达质粒pcDNA3-hLRH-1经脂质体介导转入SW480细胞中,RT-PCR和Western blot法分别检测外源基因mRNA及蛋白水平的表达;MTT法分析hLRH-1过表达对SW480细胞生长增殖的影响,同时行实时定量RT-PCR法分析细胞生长增殖相关基因Cyclin E1和Cyclin D1、以及凋亡调控相关基因Pten和Rb1的表达.结果 hLRH-1过表达的SW480细胞增殖速度明显加快,同时其Cyciin E1基因的表达显著增高,而Pten和Rb1在hLRH-1过表达的SW480细胞中均呈明显的表达下调.结论 外源hLRH-1的表达既通过上调Cyclin E1基因的表达而促进SW480细胞增殖,还可能通过调节Pten和Rb1基因的表达而参与细胞凋亡的调控.
