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筛选与克隆肝再生增强因子结合蛋白的基因
目的:人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是一种蛋白质,组织分布比较广泛,功能多样,在肝脏再生过程起一定的作用,但是其对于再生作用的机制还不清楚,采用酵母双杂交体系寻找与ALR相互作用的肝细胞蛋白,探讨ALR的生物功能.方法:应用酵母双杂交系统3,构建ALR诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有x-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析.结果:筛选出36个与ALR特异性相互作用的克隆,其中14个为金属硫蛋白,12个为人血清白蛋白,3个为硒蛋白P,1个是与GenBank中基因组数据库hgts中DNA序列(AC099651)高度同源的未知功能基因.结论:初步克隆了与ALR肝结合蛋白基因,根据所克隆到的基因,对以后研究ALR的功能有一定的提示作用;为以后研究这些能与ALR相互作用的基因在肝细胞中的生理功能奠定了基础.
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白细胞中与NS5ATP5蛋白结合的蛋白基因的筛选与克隆
目的:采用酵母双杂交体系寻找与NS5ATP5相互作用的白细胞蛋白,以探讨NS5ATP5的生物功能.方法:应用酵母双杂交系统3,构建NS5ATP5诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人白细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有x-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析.结果:筛选出10个与NS5ATP5特异性相互作用的克隆,其中1个为金属硫蛋白,1个为热休克蛋白HSP60,1个为主要组织相容性复合体Ⅱ淋巴细胞抗原DQB,5个为人类重排免疫球蛋白λ-轻链,2个是未知功能基因.结论:初步克隆了NS5ATP5与白细胞结合蛋白基因,对NS5ATP5的功能研究有一定的提示作用;为以后研究这些能与NS5ATP5相互作用的基因在白细胞中的生理功能奠定了基础.
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酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因
目的:Hcbp6是与核心蛋白相结合的未知功能蛋白基因,为了初步提示他的生物学功能和在细胞中的存在形式,采用酵母双杂交体系寻找与他相互作用的肝细胞蛋白,探讨Hcbp6的生物功能.方法:应用酵母双杂交系统3,构建Hcbp6诱饵质粒并转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,在涂有x-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析.结果:筛选出4种与Hcbp6特异性相互作用的蛋白,包括Paralemmin(PALM)、Ran结合蛋白2(Ranbp2)、跨膜运输蛋白21(Tmp21)和血清白蛋白.结论:推测该蛋白可能为一分泌性蛋白,或与分泌蛋白的形成有关,进一步的生物学功能的研究需要更多的实验加以探讨.
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脆性X智力低下蛋白与NDK/Nm23-H2的相互作用
目的筛选与脆性X智力低下蛋白(FMRP)相互作用的蛋白,为FMRP生理功能的阐释提供新线索.方法以5月龄人胚海马mRNA为模板制备cDNA,重组于DNA激活结构域载体pGAD10,构建酵母双杂交文库,从中筛选与FMRP相互作用的蛋白.应用酵母双杂交体系对FMRP的相互作用区域进行定位.结果 (1)所构建的5月龄人胚海马cDNA酵母双杂交文库含1×106克隆,插入片段平均长度约1.5 kb,有效克隆90%;(2)在该文库中筛选到一个与FMRP相互作用的阳性克隆.序列分析表明:该克隆为人的核苷酸二磷酸激酶亚基B(NDK/Nm23-H2)cDNA;(3)NDK/Nm23-H2与缺少外显子12、14-17的FMRP异构体,以及含FMRP外显子1-12的克隆相互作用,而与FMRP外显子1-6、外显子2-7不能直接结合.结论人Nm23-H2在酵母细胞内能与FMRP结合,其相互作用区域定位于FMRP的前1-11个外显子.Nm23-H2具反式调控因子特性,FMRP与Nm23-H2的相互作用提示FMRP参与基因表达调控.这一发现有助于进一步研究FMRP在细胞核内的生物学功能.
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人胎脑中hSNF5结合蛋白的筛选、克隆及分析
目的寻找在神经细胞中与染色质重塑复合物中hSNF5亚单位相结合的靶蛋白并探索其功能,为阐明hSNF5在细胞中参与染色质重塑复合物对靶基因调控的机制提供线索.方法以hSNF5为诱饵,采用酵母双杂交系统筛选人胎脑MATCHMAKER cDNA文库.测定核苷酸序列,计算机软件分析核苷酸的同源性及功能结构域.结果获得9个阳性克隆.DNA序列分析及同源性比较表明,1个克隆的序列与推导蛋白FLJ20643羧基端的mRNA同源性高达97%,4个克隆与GenBank中可编码蛋白的序列有较高的同源性,其他4个克隆编码的氨基酸顺序与GenBank中的已知序列无同源性.结论在人胎脑cDNA文库中克隆到hSNF5的结合蛋白,这些蛋白质可能通过hSNF5募集染色质重塑复合物以调节其靶基因的转录活性,及其参与的细胞功能.
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蛋白组学技术在肿瘤诊断和治疗研究方面的应用
蛋白组是1994年澳大利亚Macquarie大学的科学家Wilkins在意大利的一次科学会议上首次提出,并首次在1995年7月的"ELECTROPHORESIS"发表.后来经不断完善定义为细胞内全部蛋白的集合体,包括基因组表达的蛋白质,还包括各种形式修饰后的蛋白质.蛋白组是基因组后兴起的一项新的研究领域.它以蛋白组为研究对象,从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白组成与活动规律.蛋白组学的研究领域包括:(1)对蛋白质进行大规模鉴定并阐明其转录后修饰的特征;(2)差异显示蛋白质组学,对各种疾病进行表达水平的比较;(3)通过各种技术,如质谱分析和酵母双杂交体系来研究蛋白质间的相互作用,并绘制蛋白质作用的图谱.在肿瘤研究方面,对于肿瘤蛋白标志物的筛选及鉴定肿瘤的特异性表达,肿瘤的发生机制,肿瘤的治疗评价方面蛋白组无疑是前沿的研究领域.是目前研究热点之一.蛋白组学的核心技术是双向凝胶电泳(2DE),质谱分析(MS),生物信息学(Bioinformatics),而临床样本分析应用广泛的技术是2-DE和MALDI-MS[1,2].
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走近医学真菌
真菌学科所研究的真菌至少包括50 000种,其中多数在自然界有机物循环中起重要作用.在医学真菌中,真菌的次级代谢产物如抗生素以及免疫抑制药物如环孢素,均已被用于医疗.此外,酵母已作为一种模式生物进行基因组学、蛋白质组学、代谢组学的研究对象,例如目前研究蛋白质-蛋白质相互作用中,酵母双杂交体系对推动生命科学卓有贡献.与人类疾病密切相关的真菌种类仅为几十种.某些浅部真菌感染可引起过敏.引起哮喘病人的过敏原已在部分真菌中被确认并已由实验证明可诱生Th1/Th2类的免疫应答.随着人类免疫缺陷病毒(HIV)感染及艾滋病感染者的增多,器官移植、骨髓移植等医疗技术的更多采用,以及广谱抗生素、皮质类固醇激素和免疫抑制剂的应用,使深部真菌感染及侵袭性曲霉感染等日益呈上升趋势.进一步认识这些真菌及其引起的感染,及早作出诊断,进行有效治疗,是本世纪微生物与感染的一个重点课题.
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Max作用因子1与肾脏疾病关系的研究进展
Mad家族是由一类结构高度相似的转录抑制因子组成,研究发现其与蛋白质合成、能量代谢、细胞分化、增殖和凋亡等生理过程密切相关,目前经发现的Mad家族成员主要有Mad1、Mxi1、Mad3、Mad4、Mnt/Rox、Mga.其中Mxi1是1993年ZERVOS等[1]利用酵母双杂交体系和相互作用陷阱方法发现的,由于初观察到它能与Max发生特异性结合,故命名为Max作用因子1(max-interacting protein 1,Mxi1).Mxi1作为一种具有转录调控功能的核蛋白,其拮抗Myc的转录相关作用受到人们广泛关注.以往关于Mxi1的研究主要集中在肿瘤方面,新近针对其在多囊肾性疾病及系膜增生性疾病中的研究提示Mxi1同肾脏疾病也存在密切的关系.本文就Max1的结构、生物学特性、与肾脏疾病研究的新进展作一综述.
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酵母双杂交体系筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白相关蛋白
目的利用酵母双杂交体系筛选乙型肝炎病毒前S1(PreS1)蛋白相关蛋白,进一步探讨PreS1在乙型肝炎病毒(HBV)入胞中的作用机制. 方法以HBV DNA阳性血清为模板扩增含EcoRⅠ与PstⅠ酶切位点的PreS1基因序列,pAS2-1载体及PreS1基因PCR产物经双酶切并连接,对饵载体pAS2-1-PreS1进行序列测定;将pAS2-1-PreS1转化入酵母菌AH109,以western blot法证实其在酵母细胞中的表达.将pAS2-1-PreS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞,通过选择性培养、LacZ活性测定筛选阳性菌落,分离实验及交合实验排除假阳性,扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定,结果提交BLAST程序,在GenBank数据库查询其同源序列. 结果饵载体pAS2-1-PreS1经序列测定含有完整的PreS1基因片段,western blot证实转化的酵母细胞能正确表达完整的PreS1-BD融合蛋白.pAS2-1-PreS1与正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养共长出97个菌落,筛选出1个阳性克隆,其PCR扩增产物经GenBank数据库查询与人类初期多肽相关复合体α亚单位(NACA)高度同源. 结论成功构建了pAS2-1-PreS1饵载体,并通过酵母双杂交体系筛选出肝细胞内与PreS1相互作用的蛋白NACA.
