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MHC-表位肽四聚体技术在病毒性肝炎研究中的应用
可溶性MHC-肽四聚体是根据T细胞活化的双识别原理,用生物工程技术将MHC-Ⅰ类分子重链α与β2微球蛋白在体外组装,并结合抗原表位肽,形成一个能够与相应TCR特异性结合的单体,再将4个单体组装在一起,称为四聚体.四聚体用荧光染料标记,供流式细胞仪检测,就可以用于具有特定TCR的T细胞的研究.在病毒性肝炎的研究中,四聚体技术可以直接检测抗原特异性CTL数量,在感染急性期抗原特异性CTL比恢复期高,肝炎自愈者高于慢性感染,肝内高于外周血,但明显低于其他病毒性疾病.四聚体标记联合其他膜表面分子的标记(或细胞内细胞因子染色),可以评价抗原特异性CTL的功能状态,还可以联合一些特殊的荧光染料,评价抗原特异性CTL的分裂增生能力.
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应用四聚体酶联免疫斑点法和细胞内细胞因子染色法检测HIV-1感染者体内特异性细胞毒性T淋巴细胞的研究
目的 应用四聚体(tetramer)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICCS)方法研究HIV-1感染者细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的数量和功能.方法 应用三种tetramer检测14例HLA-A2阳性的HIV-1感染者外周血中特异性CTLs的频率,同时采用SL9(SLYNTVATL)体外冲击HIV-1感染者的外周血单核细胞(PBMCs).通过ELISPOT和ICCS方法检测产生γ-干扰素(IFN-γ)的CTLs,初步分析特异性CTLs在HIV-1感染中的作用.结果 Tetramer SL9、IV9和YI9检测出的特异性CTLs占CD8+T细胞的百分比范围分别为0.06%～3.27%,0.05%～0.57%和0.09%～0.66%;其检出阳性率分别为11/14、10/14和5/7.ELISPOT和ICCS检测的产生IFN-γ的细胞近似,但远低于tetramer检测出的病毒特异性CTLs的数量.结论 Tetramer可以敏感地检测出特异性CTLs.ELISPOT和ICCS则是研究CTLs功能的重要手段.联合使用三种方法可以更准确地评价HIV-1感染者体内CTLs的特征及其临床意义.
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PMA+Ion和PHA用于流式细胞术检测Th1/Th2细胞的结果比较
流式细胞术检测Th1/Th2细胞是近几年发展的基于细胞内细胞因子染色的新技术,可在单细胞水平区分Th1/Th2[1].采用细胞活化刺激剂诱导细胞活化,进一步刺激细胞分泌细胞因子,从而达到放大但仍能反应原有细胞因子分泌格局的目的.常用的活化刺激剂为植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)和佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)加离子霉素(ionomycin,Ion).本实验采用四色标记流式细胞术比较了上述两种刺激剂对全血检测细胞表面分子及胞内细胞因子的影响,以期为该方法的进一步优化及检测结果的分析提供可靠的依据.
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抗马干扰素-γ单克隆抗体的异硫氰酸荧光素标记及应用
目的 用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗马干扰素-γ(IFN-γ)单克隆抗体,为建立马IFN-γ细胞内细胞因子染色方法提供实验材料.方法 利用FITC标记纯化的抗马IFN-γ单克隆抗体(SB10),荧光抗体经系列稀释后,对马外周血单核细胞(PBMC)进行细胞内细胞因子IFN-γ单染色的流式细胞术检测,同时与商品化FITC标记的抗生IFN-γ单克隆抗体(CC302)进行流式细胞术检测对比试验.结果 FITC-CC302染色马PBMC,1 μl荧光抗体染色106个细胞时,分泌IFN-γ的细胞频率为9.35%,而FITC-SB10经系列稀释染色,在用0.25μl荧光抗体染色106个细胞时,分泌IFN-γ的细胞频率为9.90%.结论 所制备的FITC标记的抗马IFN-γ单克隆抗体,可为建立马细胞免疫学研究方法奠定物质基础,进而为建立监测马机体免疫状态和研究机体免疫机制提供技术平台.
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人类巨细胞病毒特异性CD8+ T细胞IFN-γ和穿孔素水平的检测
目的研究人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽(pp65495-503, NLV)特异性CD8+ T细胞的功能特性.方法将HLA-A2/NLV四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合,以流式细胞仪直接分析NLV特异性CD8+ T细胞内穿孔素的表达水平,或者在NLV抗原肽刺激6 h后分析γ-干扰素(IFN-γ)的表达水平.结果 NLV抗原肽能诱导hCMV特异性CD8+ T细胞分泌IFN-γ,不同供者特异性CD8+ T细胞产生IFN-γ的比率存在较大差异(55.69±17.64) %,当NLV抗原肽质量浓度为10 μg/mL时IFN-γ阳性细胞百分率高;未经刺激的特异性CD8+ T细胞内表达较高水平的穿孔素(53.90±16.41)%.结论识别单一表位的hCMV特异性CD8+ T细胞合成IFN-γ和穿孔素的能力存在多样性.
