首页 > 文献资料
-
乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究
目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
-
筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B转染细胞差异表达基因
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4B蛋白在丙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCV NS4B基因序列特异性的引物,以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS4B蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HCV NS4B编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS4B.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS4B蛋白的表达,提取高质量的mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有22个基因表达水平显著上调,34个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HCV NS4B转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS4B蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
-
基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3反式调节靶基因
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(non-structural protein 3,NS3)是由HCV基因组编码的具有多种功能的蛋白质.NS3蛋白的表达对于HCV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究NS3蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-NS3分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.方法:以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染hepG2细胞之后有NS3蛋白的表达,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有34个基因表达水平显著上调,37个基因表达水平显著下调.结论:HCV的NS3蛋白是一种反式激活因子.NS3基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.
-
抗表皮生长因子受体单抗基因治疗胰腺癌的实验研究
目的 EGFR靶向治疗和AAV介导的基因治疗在胰腺癌治疗方面具有广泛前景.本实验将上述两种手段相结合,构建表达人抗EGFR单链可变区抗体的rAAV载体,并筛选出对抗EGFR治疗敏感的胰腺癌细胞株.方法 以包含人IX因子基因的rAAV载体中的FIX基因替换成目的基因,转染293细胞,Western Blot法检测目的蛋白:同时将C225作用于六株胰腺癌细胞,通过CCK-8法测定生长曲线,PI染色法及Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡.结果 Western Blot 法检测到目的条带;生长曲线显示C225仅对AsPC-1的生长有明显的抑制作用(P＜0.01),Annexin V-FITC试剂盒可检测C225引起AsPC-1细胞的早期凋亡(P＜0.05).结论 rAAV载体构建成功,并在293细胞中获得表达;AsPC-1对C225的敏感性明显高于其它五株胰腺癌细胞.
-
丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达
利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体(ScFv)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV-core-ScFv.以重组的HCV核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有HCV-core-ScFv基因的噬菌体克隆.从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经NcoI/Not I酶切鉴定,该ScFv基因由750bp组成.将其亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转化大肠杆菌JM109,提取质粒进行DNA序列测定,符合ScFv的重链可变区和轻链可变区基因结构特点.IPTG诱导转化的大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV-core-ScFv的表达.酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV-core-ScFv具有重组HCV核心蛋白的反应活性和特异性.对转化的JM109大肠杆菌上清中表达的HCV-core-ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),证实表达的HCV-core-ScFv的分子量为28kDa.为应用HCV-core-ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
目的制备丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5(NS5)的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗-Id scFv),为研制HCV NS5的抗-Id scFv疫苗奠定基础.方法采用噬菌体表面展示技术,将HCV NS5单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选80个克隆,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCV NS5单克隆抗体结合活性较强的抗-Id scFv阳性克隆,并对HCV NS5特异性抗-Id scFv的编码序列进行序列测定分析.结果筛选得到的HCV NS5抗-Id scFv片段由786bp组成,具有结合HCV NS5单克隆抗体的生物学活性和特异性.结论用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCV NS5的抗-Id scFv.本实验结果为开展用抗-Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件.
-
丙型肝炎病毒包膜蛋白E2可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达
利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2的人源单链可变区抗体(ScFv)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV-E2-ScFv.以重组的HCV E2 蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有HCV-E2-ScFv基因的噬菌体克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经Nco l/Not I酶切鉴定后,该ScFv基因由750bp组成,将其亚克隆到pCANTAB5E载体中,转化大肠杆菌JM109,提取质粒进行DNA序列测定,符合ScFv的基因结构特点.IPTG诱导转化的大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV E2单链可变区抗体的表达.酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV-E2-ScFv具有与重组HCV E2蛋白的反应活性和特异性,对转化的JM109大肠杆菌上清中表述的HCV-E2-ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),证实表达的HCV-E2-ScFv的分子量为28kD.为应用HCV-E2-ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础.
-
抗 AEG-1单链可变区抗体的原核表达及纯化
目的：构建抗星形细胞上调基因1（AEG-1）单链可变区抗体（V23）的原核表达载体，并对表达蛋白进行纯化及免疫活性检测。方法应用 Primer5软件设计针对抗 AEG-1单链可变区抗体基因序列的引物，构建 PRsetC／V23原核表达质粒，经限制性内切酶 Pst1酶切以及 DNA 测序鉴定正确后，将原核表达质粒导入大肠杆菌 BL21中，构建含 V23基因的原核表达工程茵。经 IPTG 诱导后，用带 His 标签的磁珠纯化目的蛋白，SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白含量，Western blot 及 ELISA 检测抗 AEG-1单链可变区抗体的免疫活性。结果构建的原核表达质粒 PRsetC／V23经单酶切和测序分析显示，构建的 V23基因与设计序列100％一致。IPTG 诱导后，SDS-PAGE 电泳显示在31×103处出现一条明显蛋白条带，Western blot 检测在80×103处出现AEG-1特异反应条带，ELISA 检测显示阳性结果。结论成功构建了 PRsetC／V23原核表达质粒及 V23原核表达工程茵，该工程茵可表达抗 AEG-1单链可变区抗体蛋白，且该蛋白具有良好的免疫活性。
关键词： 星形细胞上调基因 1 单链可变区抗体 原核表达 -
丙型肝炎病毒NS3蛋白人源基因工程单链抗体的表达
目的在大肠杆菌XL1-Blue中表达可溶性的抗HCV非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体（single-chain variable fragment antibody，ScFv）。方法以重组的HCV NS3为抗原，利用噬菌体抗体库技术筛选含有抗-HCV NS3 ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒，经SfiI/NotⅠ酶切鉴定后，亚克隆到pCANTAB5E载体；转化大肠杆菌XL1-Blue，提取质粒进行DNA序列测定；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）诱导表达HCV NS3可溶性单链可变区抗体。ELISA和斑点吸印杂交检测其与不同来源的抗原的结合活性。结果筛选到的HCV NS3的单链抗体基因，经限制性内切酶酶切和序列分析表明，该抗体基因由750bp组成，ELISA和斑点吸印杂交结果表明，在大肠杆菌XL1-Blue中表达的HCV NS3的单链抗体，可与不同来源的NS3抗原结合。结论大肠杆菌XL1-Blue表达的NS3-ScFv具有结合不同来源的HCV NS3的活性和特异性。
-
β-淀粉样蛋白特异性单链抗体的制备及鉴定
目的 制备1株人源性的β-淀粉样蛋白(A β)特异性单链抗体(scFv),并进行性能鉴定.方法 利用噬菌体展示技术,用20个AD病人的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库.以A β1-40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一株抗A βB单链抗体H1,对其重链和轻链可变区基因进行测序分析.通过表达载体pET28a(+)对日的蛋白进行大量表达,并利用Western-blot对单链抗体H1的免疫活性进行鉴定.结果 成功构建出AD患者的单链可变区噬菌体抗体库,库容量为1.5×10~6.从库中筛选并表达出一株抗A β1-40的单链抗体H1,DNA测序结果证实了其抗体的基因结构及氨基酸序列.Western-blot检测证实该抗体可特异性结合A β1-40.结论 利用噬菌体抗体库技术可成功制备A β肽特异性单链抗体,为AD患者的临床诊断和被动免疫治疗提供了一种新的可供选择的途径.
-
乙肝病毒核心蛋白人源单链抗体在大肠杆菌中的表达
目的获得可溶性的抗乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(core )的人源单链可变区抗体(ScFv),为得到纯度高、活力强的HBc- ScFv和进一步的抗HBV 治疗奠定基础.方法采用噬菌体表面展示技术,以重组的HBV核心蛋白为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得抗原结合活性较强的乙型肝炎核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv 片段克隆,并对其进行DNA序列及免疫活性测定.从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化大肠杆菌HB2151,IPTG诱导表达乙型肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体,ELISA和western blot检测其抗原结合特异性. 结果克隆了乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体基因;经DNA酶切和序列分析表明,该抗体基因由771个碱基组成;ELISA 和western blot结果表明:在大肠杆菌HB2 151中经IPTG诱导表达的可溶性乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体,具有结合乙型肝炎核心蛋白的特异性和免疫活性.结论克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的HBc- ScFv.
-
老年痴呆噬菌体抗体库的构建及抗Aβ肽单链抗体的筛选
目的: 构建人源性的老年痴呆(AD)噬菌体抗体库,筛选1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv).方法: 利用噬菌体展示技术,用20个AD患者的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库.以Aβ40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一个抗Aβ scFv-H1,并对其重链和轻链可变区基因进行测序分析.利用预吸附实验及竞争性ELISA测定该抗体对Aβ40的特异性及结合位点. 结果: 成功构建出AD患者的单链可变区噬菌体抗体库,库容量为1.5×106.从库中筛选出1株抗Aβ40的单链噬菌体抗体-H1,DNA测序结果证实了其抗体的基因结构及氨基酸序列.预吸附及竞争性ELISA证实该抗体对Aβ40的结合表位位于蛋白氨基端的1到16个氨基酸内. 结论: 利用噬菌体抗体库技术可成功制备Aβ肽特异性scFv,为AD患者的临床诊断和被动免疫治疗提供了一种新的可供选择的途径.
-
抗细粒棘球蚴B抗原人源单链可变区抗体临床诊断价值的初步研究
目的评价人源单链可变区抗体(ScFv)诊断细粒棘球蚴病的临床价值.方法用Western-blot检测ScFv识别的抗原表位,并检测该抗体与包虫病病人囊液、血清中循环抗原的结合,与其它肝占位疾病患者血清、正常人血清的交叉反应.结果 ScFv识别囊液抗原位点单一,特异性优于多克隆抗体,交叉反应低,但检测囊液及血清循环抗原的敏感性低于多克隆抗体.结论对临床使用ScFv诊断进行了初步尝试,直接ELISA法检出率不高,应改进为双抗体夹心法或多种抗体铺底捕获法来检测循环抗原.
