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5-FC/CD 系统对荷大肠癌裸鼠肿瘤的杀伤效应
目的研究cd基因对大肠肿瘤的特异杀伤作用,探索自杀基因靶向治疗大肠癌的有效途径.方法逆转录病毒感染法将G1ceacdNa及pcd2分别转导入高分泌CEA的大肠癌细胞Lovo中,再分别接种到裸鼠皮下. 成瘤后腹腔给予5-FC(500mg/kg)治疗,观察肿瘤重量的变化及病理学特点.结果含G1ceacdNa及pcd2 逆转录病毒载体的病毒滴度分别为:1.3×107及2.1×108 CFU/L. 所有转基因成功并接种动物均成瘤. 腹腔给予5-FC治疗后发现,转由CEA基因顺式转录调控序列(TRS)驱动cd基因的组织特异性重组逆转录病毒载体G1ceacdNa的肿瘤对5-FC的敏感性明显高于转非cea调控cd基因的肿瘤,治疗结束后肿瘤重量分别为31mg±8mg及113mg±23mg(P＜0.01).结论本实验提示cea转录调控序列可控制cd基因在CEA阳性的大肠癌组织中高效表达,进而在前药5-FC 的作用下发挥选择性杀伤肿瘤的作用.
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CD基因治疗大肠癌研究进展(文献综述)
本文对近年来利用CD基因治疗大肠癌的有关研究进展进行了综述.
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胞嘧啶脱氨酶基因联合5-Fc治疗结肠癌的实验研究
目的研究胞嘧啶脱氨酶基因(CD)联合前体药物5-氟胞嘧啶(5-Fc)对结肠癌细胞的生长抑制作用.方法应用逆转录病毒介导的方法,将逆转录病毒载体pLXSN中含有大肠杆菌CD基因的重组质粒pCD2转染到病毒包装细胞PA317后, 感染人结肠癌细胞株SW1116.对转基因的细胞进行RT-PCR检测和体内外药物敏感实验.结果获得了稳定表达EC-CD基因的结肠癌细胞株SWCD2,与野生型SW1116细胞相比,SWCD2细胞对基本无毒性的原药5-Fc的敏感性增加, 50%细胞生长抑制率(IC50)浓度由野生型SW1116细胞的16 000μmol/L降低到SWCD2的66μmol/L.经5-Fc治疗后,SWCD2细胞的裸鼠移植瘤生长明显缩小.结论 CD基因联合5-Fc对人结肠癌细胞具有实验性基因治疗作用.
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人胶质瘤自杀基因细胞系的建立及其在胶质瘤治疗研究中的应用
目的 构建CD基因工程化人脑胶质瘤细胞并在此基础上进行胶质瘤治疗研究.方法 通过In-fusion基因克隆的方法,构建携带CD基因慢病毒载体;通过293T细胞体外包装获得慢病毒,并测定病毒效价;通过慢病毒体外感染细胞获得CD基因工程化人脑胶质瘤细胞;通过流式分选获得基因稳定表达细胞;通过CCK-8评价加入5-FC前药和(或)HSV-1后细胞存活率.结果 成功构建pLVX-CD-IRES-ZsGreen1慢病毒载体并体外包装获得相应慢病毒;慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞后获得携带CD基因的阳性细胞,并通过体外培养30天后流式分选获得稳定阳性细胞;加入前药5-FC和(或)HSV-1后对携带CD基因的U87细胞杀伤作用明显(P＜0.01),其中5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞作用更加高效(P＜0.01).结论 成功获得携带CD基因的人脑胶质瘤细胞;前药5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞具有更加高效的杀伤疗效.
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CD真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达
目的:构建含自杀基因胞嘧啶脱氨酶(CD)的真核表达载体pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z-CD,并进行哺乳动物细胞HEK293转染研究.方法:以本实验室保存的含CD基因全长的质粒为模版,用PCR方法扩增CD基因阅读框序列,并定向克隆到带有HAtag的pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z载体上,使目的基因与HAtag在同一阅读框.重组体质粒经EcoRI和BamHI双酶切鉴定,并对插入的CD基因片段进行测序,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z-CD用脂质体介导转染HEK293,提取细胞蛋白,western blot检测CD基因的表达情况.结果:阳性重组质粒pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z CD经EcoRI和BamHI双酶切后,获得约为5.5kb片段和1.3kb插入片段,序列分析表明插入的片段与GenBank发布的序列一致,western blot检测到CD基因的表达.结论:成功构建了含自杀基因CD的真核表达质粒.
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CD与bcl-Xs基因联合转染卵巢癌细胞株对5-氟胞嘧啶作用的影响
目的了解自杀基因胞嘧啶脱氨酶基因(cytosine deaminage,CD)及其前药5-氟胞嘧啶(5-fluorucytosine,5-FC)和bcl-Xs基因转移联合作用对卵巢癌细胞株生长的影响.方法以复制缺陷型腺病毒为载体将CD基因和bcl-Xs基因体外转染大鼠卵巢癌细胞株NUTU-19细胞,加入含5-FC的培养基.MTT法检测培养细胞吸光度值,计算细胞存活率.结果单一bcl-Xs基因转移及单一CD/5-FC系统作用对NUTU-19细胞的生长抑制作用均随病毒滴度的增加而增大;将两者联合作用于NU-TU-19细胞,其生长抑制率比两者单独使用时的生长抑制率之和更高,表现为协同效应(P＜0.0001).结论CD/5-FC系统与bcl-Xs基因转移联合使用对NUTU-19细胞的生长抑制具有协同作用.
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腺病毒载体介导的CD自杀基因体外抑瘤效果观察
目的:构建含CD基因的腺病毒载体pAd-CD, 进行肿瘤的自杀基因治疗.方法:分别构建了含CD基因和LacZ基因的重组病毒质粒载体,同质粒pJM17共转染293细胞同源重组后包装为感染性腺病毒颗粒,经滴度测定后,体外分别感染小鼠前胃癌肿瘤细胞MFC.结果:感染Ad-LacZ的细胞可被X-gal染成蓝色,感染Ad-CD的细胞予前药5-FC可见肿瘤细胞杀伤效果明显.结论:腺病毒载体可有效地转CD和LacZ基因进入肿瘤细胞,C D基因作为自杀基因进行体外肿瘤治疗效果明显,本实验构建的新载体及结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了基础.
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含有CD基因的腺病毒载体的构建
目的:构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体.方法:先将真核表达载体质粒pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中,后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内.结果:经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体,对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义.
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CD、Flt-1基因对原代培养的恶性胶质瘤细胞VEGF表达及生长的影响
目的 研究CD、Flt-1基因对恶性胶质瘤细胞VEGF表达及生长的抑制作用.方法 CD、FLT-1基因共表达质粒pEGFP-C1-CD-Flt-1转染恶性胶质瘤细胞,ELISA法检测培养液上清中VFGF含量,实时定量PCR及免疫组化检测细胞VEGFmRNA及蛋白的表达,通过MTT法和流式细胞术观察其对细胞活性的影响.结果 转染72h后实验组细胞VEGFmRNA及蛋白水平显著降低,培养液中VEGF含量降低,细胞活性受到抑制,流式细胞术发现实验组细胞的G1期细胞比例明显高于对照组,细胞出现凋亡.结论 重组质粒pEGFP-C1-CD-Flt-1,其体外可抑制恶性胶质瘤细胞VEGFmRNA及蛋白的表达,抑制细胞活性、诱导细胞凋亡.
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CD、Flt—1基因共表达重组质粒的构建及对BT325细胞增殖的抑制作用
目的 构建CD、Flt—1基因共表达重组质粒,并检测其对BT325细胞增殖抑制的影响.方法 从大肠杆菌及人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链式反应(RT—RCR)扩增CD基因和FLT-1基因片段,应用基因重组技术将CD基因和Flt—1基因片段克隆到真核表达载体pEGFP— C1中,经酶切鉴定及DNA序列分析证实所构建的载体.转染BT325细胞株,通过MTT法和流式细胞术观察其对细胞的增殖抑制作用.结果 RT-RCR方法获得CD基因和Flt—1基因片段,酶切分析和DNA测序鉴定表明重组质粒pEGFP—C1— CD— Flt—1构建成功.转染72h后实验组细胞生长速度是control组的(33.2％±5.4％),流式细胞术发现实验组细胞的G1期细胞比例明显高于control组,细胞出现凋亡,实验组细胞的凋亡率为(19.7％±5.45％).结论 成功构建真核表达重组质粒pEGFP—C1—CD— Flt—1,其体外可抑制BT325增殖并诱导其凋亡.
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CD基因修饰的神经干细胞对C6胶质瘤细胞的作用
目的 研究CD基因修饰神经干细胞(NSCs)对脑胶质瘤细胞的抑制作用、效果及机制,为NSCs在脑胶质瘤治疗中的应用提供理论依据.方法 以胎脑作为供体,采用神经球形成法培养NSCs,脂质体介导CD基因转染NSCs,G418筛选.NSCs/CD与C6胶质瘤细胞分组共培养,MTT检测细胞存活情况.结果 成功构建CD基因转染NSCs,NSCs/CD对C6细胞生长有明显抑制作用.结论 NSCs是良好的载体,NSCs/CD-5-FC自杀基因治疗系统具有很强的抗肿瘤效果.
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肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pTRKH2-PsT/CD、pTRKH2-PsT/UPRT的构建
目的 利用婴儿双歧杆菌对实体瘤低氧区的靶向效应,构建肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pTRKH2-PsT/CD和pTRKH2-PsT/UPRT.方法 用PCR的方法从质粒pGEX/CD和pGEX/UP-RT中扩增出CD基因和UPRT基因,双酶切CD基因、UPRT基因和质粒pTRKH2-PsT,分别连接后重组于大肠杆菌中.之后用电转化的方法将重组质粒转入婴儿双歧杆菌中.用RT-PCR检测该系统mR-NA水平的表达,SDS-PAGE检测该系统在蛋白质水平的表达.在黑色素瘤B16-F10细胞上检测该系统的体外肿瘤细胞杀伤效果.结果 成功地将CD基因和UPRT基因转入了质粒pTRKH2-PsT,CD基因和UPRT基因的测序结果表明序列与Genebank公布的序列一致.RT-PCR检测到CD和UPRTmRNA水平的明显表达.在含有CD基因的婴儿双歧杆菌细胞全蛋白中发现了CD蛋白质的表达,在合有UPRT基因的婴儿双歧杆菌上清液中发现了UPRT蛋白质的表达.黑色素瘤细胞的低存活率证明了pTRKH2-PST/CD、pTRKH2-PsT/UPRT自杀基因治疗系统对黑色素瘤的显著杀伤作用.结论 肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pTRKH2-PsT/CD、pTRKH2-PsT/UPRT构建成功并显示出杀伤肿瘤细胞的作用.
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热化疗对转CD基因结肠癌细胞SW480的杀伤作用
目的探讨5-氟胞嘧啶(5-FC)热化疗对转染组织特异性胞嘧啶脱氨基酶(CD)基因的大肠癌细胞SW480的作用.方法采用脂质体法将CEA基因顺式转录调控序列(TRS)驱动CD基因的组织特异性逆转录病毒载体G1 CEACDNa转导入大肠癌细胞SW480,以G418筛选阳性克隆扩增后,采用水浴加温法,43℃作用30min共3次,同时给予5-FC进行敏感试验;RT-PCR法检测目的基因在靶细胞的表达.结果SW480-CEACD细胞在43℃作用30min共3次条件下,CD基因能稳定表达;热疗本身对SW480细胞有一定的杀伤作用(P＜0.05),转CD基因后,SW480细胞对5-FC的敏感性明显提高(P＜0.01),热疗与前药5-FC合用,对SW480-CEACD的杀伤作用显著大于对未转基因细胞的杀伤作用(P＜0.01),亦大于单独应用5-FC时对SW480-CEACD细胞的杀伤作用(P＜0.05),热化疗增加了SW480-CEACD细胞对5-FC的敏感性,并可观察到明显的旁观者效应.结论热疗与5-FC联合应用,提高了CEA组织特异性CD/5-FC系统对结肠癌细胞SW480的靶向性杀伤作用.
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rPB-DR(6)调控的溶瘤腺病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用
目的 构建含rPB-DR(6)启动子和CD自杀基因的重组溶瘤腺病毒,观测其对雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞的杀伤作用,探索雄激素非依赖性前列腺癌治疗的新方法.方法 应用分子生物学技术,构建并包装出重组溶瘤腺病毒Ad5-rPC,纯化并扩增,测定滴度.采用PCR方法对重组溶瘤腺病毒颗粒进行鉴定并测序,Western blot检测E1A、CD蛋白表达,TCID50法检测重组腺病毒感染癌细胞后的复制能力,应用CCK-8法检测重组病毒特异性杀伤能力.结果 经PCR及测序鉴定证实成功构建了包含rPB-DR(6)启动子和CD基因的重组溶瘤腺病毒Ad5-rPC,测滴度为1.1×1011pfu/mL.Western blot检测到E1A和CD蛋白阳性表达.Ad5-rPC病毒感染前列腺癌细胞系细胞产生的子代病毒滴度均大于3.0×106pfu/mL,CCK-8法证实重组腺病毒对雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞均具有特异性杀伤能力,杀伤能力均大于65％.结论 前列腺特异性启动子调控的溶瘤腺病毒能在前列腺癌细胞内靶向复制,并对雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞均有特异性杀伤作用.
关键词： 溶瘤腺病毒 rPB-DR(6)启动子 cd基因 前列腺癌 基因治疗 -
CD基因构建及鉴定
目的利用分子生物学技术,构建胞嘧啶脱胺酶(CD)自杀基因并测定其结构,证实与GENBANK发表的序列具有同源性.为该自杀基因的进一步研究提供良好的实验基础.方法以大肠杆菌JM109基因组为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)法,扩增出约为1280 bp CD基因,定向克隆到载体PEGM-T,构建克隆载体.两端分别引入限制性内切酶BamH I、Not I酶切位点,经PCR及酶切鉴定初步证实为重组体后,送上海生物工程技术服务有限公司测序认证.结果经PCR、酶切鉴定和测序鉴定完成CD基因的构建,同源性高达99.30%,完全具备表达该目的基因的要求.结论成功扩增出CD基因,为继续研究打下基础.
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放射敏感性启动子调控CD基因/5-FC自杀系统慢病毒载体的构建及125I诱导表达的研究
合成了含8个CArG元件的放射敏感性启动子E8,将其连接于胞嘧啶脱氨酶(Cytosine Deaminase,CD)基因及GFP报告基因上游,构建了重组慢病毒载体pGC-FU- E8 codA- GFP.与慢病毒包装系统共转染293T细胞包装重组慢病毒颗粒E8 -coda- GFP LV,研究重组慢病毒感染EJ细胞在不同剂量125I的电离辐射下绿色荧光表达情况及其将5 -FC转化为5- FU的能力.结果显示:构建的含有E8启动子及CD基因的重组慢病毒载体,包装的重组慢病毒滴度为2×108 TU/mL；经125I照射的重组慢病毒感染EJ细胞均可观察到绿色荧光,其细胞上清液均可检测到5- FC转化成的5- FU紫外峰,其中55.5 kBq及74.0 kBq 125I照射的细胞组绿色荧光明显,148 kBq125I照射的细胞组,其5 -FU紫外峰为明显.以上结果表明:本工作所构建的放射敏感性启动子调控CD 基因/5 -FC自杀系统重组慢病毒载体具有电离辐射调控作用,可在125I的电离辐射作用下诱导下游基因表达,为放射性核素125I联合CD基因/5 -FC自杀系统对肿瘤细胞的治疗作用研究提供了实验基础.
