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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白新基因C-12的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于细胞核和胞质中,对于病毒前基因组RNA装配入核壳体是必须的,HBcAg还是HBV介导体液免疫反应和CD4+T细胞免疫反应的重要抗原,寻找人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因,是研究HBcAg生物学功能的重要途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-d-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank的信息设计新基因的引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录PCR扩增出C-12#新基因的完整序列,连入另一酵母表达载体pGADT7,并转化进酵母细胞Y187,再次与转化了诱饵质粒的酵母细胞AH109配合(回交),以进一步证实HBcAg与C-12#新基因编码蛋白的结合作用.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中的表达,配合后选出既能在四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中未知基因4个.用自行设计的引物成功地从HepG2细胞的mRNA中扩增出C-12#新基因的完整序列,回交实验证实二者之间的结合作用.结论:成功克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白,发现未知功能基因,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心抗原反式调节基因
目的:筛选与克隆HBcAg反式调节基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:以分子生物学技术构建HBcAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBcAg,以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBcAg激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得17种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢及肿瘤发生密切相关的蛋白编码基因,推测了HBcAg在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白C-12相互作用蛋白的研究
目的:筛选并克隆人肝细胞中与HBcAg肝细胞结合蛋白C-12新基因相互作用蛋白的基因,进一步探讨HBcAg结合蛋白C-12新基因的生物学功能.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增C-12基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出C-12基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落21个,其中含金属硫蛋白A2基因的菌落有3个、组织蛋白酶B基因1个、载脂蛋白M基因1个、细胞色素C氧化酶Ⅱ基因3个、人类受体蛋白酪氨酸激酶变异因子基因1个、KH型剪接调控蛋白基因1个、磷脂酰肌醇脱酰酶聚糖Q转录变异因子1基因1个、铁蛋白轻链基因2个、鸟氨酸脱羧酶1基因1个、血液凝固因子Ⅸ基因1个、乙酰乳酸合酶基因1个、钙激活蛋白酶基因1个、核外三磷酸盐双磷脂酰水解酶5基因1个、血浆α-球蛋白抑制因子H4基因1个和未知蛋白基因2个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白C-12新基因相互作用蛋白的编码基因,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
