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Arkadia上调转化生长因子-B信号促进卵蛋白致敏大鼠气道重塑形成
支气管哮喘(简称哮喘)所致气道重塑的发生与转化生长因子(TGF)-β信号通路的活化密切关联.TGF-β生物学效应的发挥在很大程度上依赖于泛素蛋白酶体通路对TGF -β/Smad通路中基本信号分子的降解而得以实现.在上述过程中,E3泛素连接酶Arkadia和Smurf2能够诱导Smad7、SnoN和Ski的泛素化降解.本研究为明确卵蛋白致敏大鼠气道重塑发生过程中Arkadia和Smurf2对TGF-β信号通路的调控作用,采用卵蛋白致敏、激发方法建立慢性气道重塑大鼠模型;体外培养正常人支气管上皮细胞( NHBEC),用TGF-β1对NHBEC进行刺激,在此过程中分别用Arkadia-siRNA、Smurf2 -siRNA及蛋白酶抑制剂(lactacystin)对NHBEC进行预处理.
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蛋白酶体功能与帕金森病相关性实验研究
目的观察蛋白酶体抑制剂诱导大鼠黑质多巴胺能神经元α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)的表达及聚集,探讨蛋白酶体功能在帕金森病(PD)发病中的作用机制.方法采用立体定向将蛋白酶体抑制剂Lactacys-tin注射至大鼠黑质部位.以免疫荧光法观察黑质区多巴胺能神经元变性缺失,并应用免疫荧光双标法观察多巴胺能神经元内蛋白聚集的包涵体及其主要成分α-Syn的表达,然后通过原位杂交分析α-Syn mRNA表达及Western印迹法检测黑质α-Syn表达量改变.结果注射Lactacystin第7天大鼠开始出现自发性活动减少,阿扑吗啡尚可诱导出旋转行为;3周后患侧黑质部位酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞明显减少.TH与硫磺素、硫磺素与α-Syn复合染色呈阳性.α-Syn mRNA表达量升高,蛋白表达水平增加.结论Lactacystin诱导大鼠黑质细胞α-Syn表达升高并出现蛋白聚集可能是导致PD发病的机制之一.
关键词： lactacystin 帕金森病 α-突触核蛋白 聚集 -
独活香豆素对乳胞素诱导的帕金森病模型大鼠血清炎症因子的影响
目的:探讨独活香豆素对帕金森病模型大鼠血清炎症因子的影响.方法:利用乳胞素(Lactacystin)脑黑质致密部注射建立帕金森病(PD)大鼠模型,于第7、14、21、28天进行阿扑吗啡(APO)检测,根据大鼠行为学异常程度,应用分层随机法将模型复制的大鼠随机分为模型对照组、吐温80组、独活香豆素组、独活颗粒剂组、独活复方颗粒剂组、塞来昔布组、美多芭组7组.另设假手术组和正常对照组,假手术组脑黑质致密部注射等量生理盐水.正常对照组、假手术组、模型对照组用生理盐水灌胃,其他组大鼠同时间予以等体积相应药物灌胃,共10周.给药后第14、28、42、56、70天分别进行APO检测,观察记录其旋转行为异常、旋转方向、旋转圈数.在进行后一次APO检测后的次日,每组随机取8只大鼠采用ELISA方法检测其血清中IL-1α、IL-1β、IL-6及TNF-α的含量.结果:独活香豆素能改善PD模型大鼠行为学异常,降低血清IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子的异常升高.结论:独活香豆素有可能是通过降低大鼠血清IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子的表达,对PD起到保护作用.
关键词： 帕金森病 独活香豆素 炎症因子 lactacystin -
垂体腺苷酸环化酶激活肽拮抗lactacystin细胞毒性的作用
背景：帕金森病的发病机制未明确，目前尚没有有效的治疗方法能从根本上阻止其病程进展。目的：分析垂体腺苷酸环化酶激活肽对lactacystin诱导的帕金森病多巴胺能PC12细胞凋亡的影响及其分子机制。方法：用神经生长因子将 PC12细胞诱导分化成神经元的细胞模型，经不同浓度泛素-蛋白酶体抑制剂lactacystin处理，分别作用不同时间，取细胞存活约为50%的lactacystin作用浓度与时间，建立帕金森病细胞实验模型。实验分组：对照组、lactacystin组、垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27干预组(干预1组)、垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27和垂体腺苷酸环化酶激活肽6-27共同干预组(干预2组)。观察各组细胞形态变化；MTT法检测细胞活力；免疫印迹(Western blot)法检测内质网应激特异性蛋白caspase-12的表达情况。并观察垂体腺苷酸环化酶激活肽1-26及垂体腺苷酸环化酶激活肽6-27对lactacystin毒性作用的影响。结果与结论：不同浓度及作用时间的 lactacystin 处理 PC12细胞后，细胞活力呈浓度及时间依赖性下降，其中lactacystin 20μmol/L作用24 h使细胞活力下降约50%。在相同的lactacystin作用条件下(20μmol/L，24 h)，与对照组比较，lactacystin组细胞发生损伤性改变，细胞活力降低，caspase-12活性明显升高(P<0.01)；与lactacystin 组比较，干预1组细胞损伤性改变明显好转，细胞活力增强，下调凋亡蛋白 caspase-12的表达(P <0.01)。干预2组细胞状态则明显不如干预1组，与lactacystin组相差不大。结果提示泛素-蛋白酶体抑制剂lactacystin引起内质网应激导致细胞损伤；垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27通过调节上述信号通路发挥保护作用。而作为垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27的受体拮抗剂，垂体腺苷酸环化酶激活肽6-27则减弱了垂体腺苷酸环化酶激活肽1-27的这一作用。
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蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元变性伴包涵体形成
目的观察蛋白酶体抑制剂诱导黑质多巴胺(DA)能神经元变性伴胞浆内包涵体形成, 探讨蛋白酶体功能在帕金森病发病机制中的作用.方法将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射至大鼠黑质部位.免疫荧光观察黑质区DA神经元变性缺失及胶质细胞变化.免疫荧光双标法观察DA能神经元内蛋白聚集的包涵体及其主要成分α-共核蛋白(α-synuclein)、Parkin 和泛素(ubiquitin)的表达.同时观察DA能神经元发生细胞凋亡.结果注射Lactacystin第7天大鼠开始出现自发性活动减少,阿扑吗啡可诱导出旋转行为;3周后黑质部位酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞减少,呈剂量依赖性;小胶质细胞增生明显.TH与硫磺素、硫磺素与α-synuclein、硫磺素与Parkin、以及硫磺素与ubiquitin复合染色呈阳性;TH与 TUNEL双染亦呈阳性.结论 Lactacystin对多巴胺能神经元具有毒性作用,且导致蛋白聚集,包涵体形成.蛋白酶体功能异常可能在帕金森发病机制中起重要作用.
关键词： lactacystin 帕金森病 α-共核蛋白 Parkin 泛素 -
Lactacystin诱导帕金森病大鼠黑质小胶质细胞、CD68和环氧化酶-2表达的变化
目的:研究蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导大鼠黑质小胶质细胞的数量、活化程度的变化及环氧化酶-2(COX-2)的表达.方法:采用立体定向术将10 μg lactacystin注射至大鼠黑质部位,免疫组织化学观察黑质区多巴胺能神经元和小胶质细胞数量、小胶质细胞活化程度(CD68)的变化及炎性介质COX-2的表达；RT-PCR方法检测TH mRNA和CD68 mR-NA的转录变化情况.结果:注射lactacystin 3周后,阿扑吗啡腹腔注射诱导大鼠出现典型旋转行为；4周时模型组大鼠损毁侧黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数明显减少,黑质小胶质细胞数量增加,CD68和COX-2的表达均增强,与对照组相比,差异均有统计学意义.模型组TH mRNA表达低于对照组,CD68 mRNA表达高于对照组,差异均有统计学意义.结论:蛋白酶体抑制剂lactacystin能激活大鼠黑质小胶质细胞,诱导与炎症发生有关的CD68和COX-2的表达.
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Lactacystin对酪氨酸羟化酶基因和蛋白表达的影响
目的:探讨lactacystin对酪氨酸羟化酶(TH)基因及蛋白表达的影响.方法:在大鼠单侧黑质致密部(SNc)立体定向注射蛋白酶体抑制剂lactacystin 0.2、2、8 μg抑制α-synuclein的降解,对照组注射等量生理盐水,观察大鼠自主行为和阿扑吗啡诱导的旋转行为变化;应用免疫组化观察黑质细胞α-synuclein和TH蛋白表达;采用RT-PCR方法测定黑质细胞TH mRNA的表达.结果:注射lactacystin 0.2 μg组未见异常;2和8 μg 组大鼠出现进行性的运动迟缓、少动、头向对侧倾斜、震颤,但后者更加明显并出现阿扑吗啡诱导的向对侧旋转运动;给药后3周注射lactacystin 2 和8 μg组大鼠黑质细胞α-synuclein表达分别较对照组高出56.71%(P<0.01)和122.16%(P<0.001);部分细胞胞质内出现α-synuclein免疫反应呈强阳性的Lewy小体;TH mRNA和蛋白的表达分别较对照组减少了63.34%(P<0.001)、60.55%(P<0.05)和81.95%(P<0.001)、89.53%(P<0.01).结论:lactacystin对中脑黑质细胞TH基因及蛋白表达均有显著的抑制作用,参与了lactacystin所致的帕金森病发病机制.
关键词： lactacystin 酪氨酸羟化酶 α-synuclein -
百草枯与lactacystin对黑质细胞协同毒性作用
目的:探讨百草枯(PQ)与lactacystin对黑质细胞的协同毒性作用.方法:取SD雄性大鼠56只,随机分为NS组、lactacystin组(以下简称lact组)、PQ组和双因素组,每组14只.PQ组和双因素组预先每日口服小剂量PQ 0.5 mg·kg-1,NS组和lact组每日口服等量的NS,连续喂养8周后,在lact组和双因素组大鼠单侧SNc立体定向注射低剂量蛋白酶体抑制剂lactacystin 2 μg,NS组和PQ组注射等量的NS.观察大鼠行为变化、TH阳性细胞数以及α-synuclein蛋白表达变化.结果:仅双因素组大鼠出现严重的动作迟缓、少动、姿势异常以及APO诱导的持续左向旋转;黑质部TH阳性细胞数较NS组显著减少,且大于lact组和PQ组两组减少之和(P＜0.05);双因素组黑质细胞α-synuclein的表达较NS组显著增高,多数细胞内出现α-synuclein免疫反应呈强阳性的Lewy小体.结论:lactacystin与PQ之间存在协同作用,长期小剂量PQ的暴露能显著增加蛋白酶体功能轻微损害的大鼠患PD的风险.
关键词： 百草枯 lactacystin 帕金森病 -
应用蛋白酶体抑制剂Lactacystin建立有Lewy体的帕金森病大鼠模型
目的 建立符合帕金森病(PD)病理特征--黑质细胞有Lewy体的PD大鼠模型.方法 分别在大鼠一侧黑质致密部注射蛋白酶体抑制剂Lactacystin 8 mg(Lactacystin组)、等体积生理盐水(NS组)和6-羟基多巴胺(6-OHDA组)12 mg;观察大鼠自主行为和阿朴吗啡诱导的旋转行为;光镜下观察中脑组织学改变;应用免疫组化染色观察黑质细胞α-synuclein表达和酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数;测定纹状体区多巴胺和高香草酸含量.结果 NS组大鼠未见行为异常;Lactacystin组大鼠出现进行性的运动迟缓、少动、震颤、头向健侧倾斜,注射阿朴吗啡后出现向健侧旋转运动;给药后3周黑质部TH阳性细胞数较NS组减少了83.29%(P＜0.01),部分黑质细胞内出现α-synuclein免疫反应呈强阳性的Lewy体;纹状体多巴胺和高香草酸含量(154.82±37.17,98.66±18.81)较NS组明显减少(822.87±131.25,617.77±95.74)(均P＜0.01);6-OHDA组大鼠出现与Lactacystin组类似的行为变化,黑质细胞亦显著减少,但未见Lewy体.结论 利用蛋白酶体抑制剂Lactacystin阻碍α-synuclein的降解可以建立有Lewy体的PD大鼠模型.
关键词： lactacystin 蛋白酶体 α-synuclein Lewy体 -
DMT1在SH-SY5Y细胞α-突触核蛋白聚集中的作用研究
目的 探讨二价金属离子转运蛋白1 (DMT1)在lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞α-突触核蛋白(α-SYN)聚集中的作用.方法 SH-SY5Y细胞处理分为正常对照组和lactacystin损伤组.lactacystin损伤组加入lactacystin 10 μmol/L处理24h.免疫荧光法、流式细胞术测定法检测DMT1表达情况,Calcein-AM荧光检测细胞的摄铁能力,荧光探针carboxy-H2DCFDA检测胞内氧化应激水平,JC-1染色检测线粒体膜电位.结果 与正常对照组相比,lactacystin损伤组DMT1表达增加1.3倍,细胞摄铁能力增强1.3倍,胞内氧化应激水平增高1.6倍,线粒体膜电位下降了65.0％.结论 DMT1介导的细胞摄铁能力增强,引发细胞线粒体膜电位降低、活性氧生成过多,进而促进胞内α-SYN的异常聚集,终导致PD神经元损伤.
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蛋白酶体抑制剂诱导大鼠运动行为改变的研究
目的 观察蛋白酶体抑制剂诱导大鼠黑质变性及大鼠运动行为改变,探讨蛋白酶体功能下降在帕金森病发病机制中的作用.方法 将蛋白酶体抑制剂立体定向注射入大鼠左侧黑质致密部,对照组注射等体积的生理盐水.观察大鼠自主行为和阿朴吗啡诱导的旋转行为的改变.开野实验观察大鼠自发运动行为改变.免疫组织化学法观察黑质致密部及纹状体内酪氨酸羟化酶的表达.结果 Lactacystin组大鼠给药一周后出现自发性活动减少,动作缓慢,震颤、对外界刺激不自主竖毛,且症状逐步加重;阿朴吗啡可诱导出向健侧的旋转运动.开野实验中,Lactacystin组大鼠自发运动行为出现改变.三周后黑质部位酪氨酸羟化酶免疫阳性细胞及纹状体内酪氨酸羟化酶免疫阳性神经纤维减少.结论 蛋白酶体抑制剂Lactacystin单侧黑质致密部微量注射可以诱导大鼠黑质变性并出现运动行为改变,蛋白酶体抑制剂在帕金森病动物模型制备上有潜在价值,蛋白酶体功能下降可能在帕金森病发病机制中起重要作用.
关键词： 帕金森病 lactacystin 黑质 行为 -
人参皂苷Rg1对lactacystin诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
目的:探讨人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1,Rg1)对lactacystin所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及可能机制.方法:实验分正常对照组、lactacystin组、lactacystin和Rg1联合处理组(0.1,1,10 μmol/L),分别用CCK-8检测细胞活力,免疫荧光法、流式细胞术测定法检测二价金属离子转运蛋白1 (divalent metal transporter 1,DMT1)表达情况,calcein-AM荧光检测细胞的摄铁能力,JC-1染色检测细胞线粒体膜电位,荧光探针carboxy-H2DCFDA检测胞内氧化应激水平.结果:与lactacystin组相比,lactacystin和Rg1联合处理组的细胞活力显著增加,细胞DMT1表达减少,细胞摄铁能力下降,线粒体膜电位增加,胞内氧化应激水平降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:Rgl对lactacystin诱导损伤的SHSY5Y细胞具有一定的神经保护作用,其作用机制可能与下调DMT1介导的细胞摄铁能力,稳定线粒体膜电位,降低氧化应激反应有关.
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蛋白酶体抑制剂Lactacystin对大鼠行为学和黑质神经元形态学的影响
目的 研究蛋白酶体抑制剂Lactacystin对大鼠行为和黑质神经元形态学的影响.方法 Lactacystin组单侧注射蛋白酶体抑制剂Lactacystin 10μg至大鼠黑质致密部,对照组注射等体积生理盐水,观察两组大鼠的行为学变化、黑质神经元酪氨酸羟化酶(TH)表达和黑质神经元的超微结构特点.结果 Lactacystin组大鼠出现进行性的运动迟缓、震颤,注射阿朴吗啡后大鼠向健侧恒定旋转.Lactacystin组大鼠黑质致密部健侧与损毁侧TH阳性细胞数之比均较对照组显著降低.电镜下可见Lactacystin组大鼠黑质神经细胞核明显内陷或不完整,核内染色质有凝集现象,核仁边移,胞浆内黑色素颗粒极少,线粒体肿胀或空泡样变,粗面内质网脱颗粒.结论 蛋白酶体抑制剂Lactacystin可引起大鼠行为学和黑质神经元发生凋亡的超微结构改变.
关键词： 帕金森病 lactacystin 行为学 形态学 大鼠 -
热休克蛋白对多巴胺能神经细胞的保护作用研究
目的 探讨热休克蛋白(HSP)对蛋白酶体抑制剂处理的多巴胺能神经细胞的活力以及细胞内包涵体形成的影响.方法 将PC12细胞进行热处理,免疫印迹法鉴定热休克蛋白表达,并确定佳热处理条件;再应用高选择性的蛋白酶体抑制剂Lactacystin处理PC12细胞.MTT方法 检测细胞活力,免疫荧光细胞化学染色观察细胞内包涵体形成的变化.结果 免疫印迹法证实PC12细胞热处理2 h后HSP70水平即开始迅速升高,一直持续至24 h,其中4 h的HSP70水平表达较高,故选其为佳观察条件.未经热处理的对照组经5 μM、10 μM、15 μM和20 μM Lactacystin处理24 h后,PC12细胞的活力显著降低,呈剂量依赖性;热处理组的细胞活力比对照组显著升高,两者有显著性差异(P＜0.01).免疫荧光染色显示对照组细胞的胞浆内包涵体明显增多,而热处理组胞浆内包涵体明显减少.结论 热休克蛋白能显著增强细胞活力,减少细胞内包涵体形成,对多巴胺能神经元可能有一定的保护作用.
关键词： 热休克蛋白 lactacystin PC12细胞 帕金森病 -
蛋白酶体抑制剂诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成
目的 观察蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成及运动行为学的改变,探讨蛋白酶体功能下降在帕金森病(PDl发病机制中的作用. 方法 24只SD大鼠采用随机数字表法分为kactacystin实验组和生理盐水组.每组12只,Lactacystin实验组将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射人大鼠左侧黑质致密部(SNc).生理盐水组注射等体积生理盐水;观察大鼠自主行为和阿朴吗啡(APO)诱导的旋转行为的改变;Nissl染色法观察SNc病理改变;免疫组化法观察SNc及纹状体酪氨酸羟化酶(TH)和SNc中α-共核蛋白的表达;透射电镜观察SNc超微结构的改变. 结果 Lactacystin实验组大鼠给药7 d后出现自发性活动减少、动作缓慢、震颤、且症状逐步加重.APO可诱导出向健侧的旋转运动;Nissl染色发现Lactacystin实验组左侧SNc神经元数量减少,尼氏体结构松散;免疫组化结果表明21 d后Lactacystin实验组左侧SNc出现变性,TH免疫阳性神经元数量减少,α-共核蛋白表达增强,纹状体内TH免疫阳性纤维数量减少;电镜观察到蛋白质聚集形成的包涵体. 结论 Lactacystin单侧SNc注射可以诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成及大鼠行为改变.蛋白酶体功能下降可能在PD发病机制中起重要作用.
关键词： 帕金森病 lactacystin α-共核蛋白 蛋白酶体 包涵体 -
灵芝孢子提取物对Lactacystin致PC12细胞损伤的保护作用
[目的]探讨灵芝孢子提取物对Lactacystin诱导PC12细胞损伤的保护作用.[方法]体外培养PC12细胞,建立Lactacystin诱导PC12细胞损伤的模型,观察细胞形态,用CCK-8法检测细胞活力,annexinV-FITC/PI流式细胞法检测细胞调亡.[结果]用不同浓度的灵芝孢子提取物处理PC12细胞时,细胞存活率与对照几乎一致,并未表现出细胞毒性.经20 μmol/L的Lactacystin处理24h后,PC12细胞活力比对照组降低,仅为对照组的63.2％.模型组经不同浓度的是芝孢子提取物预处理后,细胞活力明显提高,其保护作用随浓度升高而升高.Lactacystin诱导PC12细胞凋亡,处理24h后细胞凋亡率为48.86％,经灵芝孢子提取物处理后,细胞凋亡率明显降低.[结论]Lactacystin 能诱PC12细胞凋亡,灵芝孢子提取物能对Lactacystin致PC12细胞损伤有一定的保护作用.
关键词： 灵芝孢子提取物 lactacystin PC12细胞 -
Minocycline对Lactacystin大鼠模型黑质胶质活化和多巴胺神经元生存的干预作用
目的:观察米诺环素(Minocycline,Mino)对Lactacystin (Lac)模型黑质内胶质细胞反应和多巴胺神经元的干预作用.方法:成年SD大鼠30只随机分为对照、Lac1 W、Lac3 W、Lac5 W、Lac+ Mino5 W组,进行Lac动物模型制备和Mino给药处理,通过免疫组织化学和Western blot方法,观察iba1(小胶质细胞标志物)、GFAP(星形胶质细胞标志物)、TH(多巴胺能神经元标志物)的表达水平或阳性细胞数量变化,分析评价黑质内胶质细胞反应和多巴胺神经元生存状态.结果:Lac处理模型黑质内胶质细胞呈现动态活化反应.与生理盐水对照组相比,Lac处理均诱导iba1和GFAP表达水平升高,iba1在Lac3 W组显著升高、并持续高水平至Lac5 W(P ＜0.05).GFAP表达在Lac1 W已显著升高、维持至Lac3 W和Lac5 W(P ＜0.05).伴随胶质细胞的显著活化反应,黑质内TH阳性神经元数量急剧减少(P＜0.01).与Lac5 W组相比,Lac+ Mino5 W组呈现对iba1和GFAP阳性胶质细胞的抑制效应、并提高黑质内TH阳性细胞数量,具有统计学意义(P＜0.05).结论:小胶质细胞抑制剂米诺环素给药处理可能通过干扰胶质细胞的异常活化反应、发挥对Lac损伤模型黑质多巴胺能神经元的一定保护作用.
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Lactacystin诱导大鼠黑质小胶质细胞的变化及炎性介质的表达
目的:观察蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导大鼠黑质小胶质细胞的变化及炎性介质的表达.方法:采用立体定向术将不同剂量(2μg,10μg)的蛋白酶体抑制剂Lactacystin注射至大鼠黑质部位,免疫组织化学法观察黑质区多巴胺能神经元和小胶质细胞的变化及炎性介质环氧化酶2(COX-2)、核转录因子κB(NF-κB)的表达.结果:注射不同剂量Lactacystin 14 d,阿扑吗啡腹腔注射后2 μg Lactacystin组大鼠无旋转行为,10 μg Lactacystin组出现典型旋转行为;8周后2 μg Lactacystin组大鼠损毁侧黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数明显减少,2μg和10μg Lactacystin组黑质小胶质细胞数量均增加,炎性介质COX-2、NF-κB表达均增强.结论:蛋白酶体抑制剂Lactacystin能激活大鼠黑质小胶质细胞,诱导炎性介质表达.
