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心脏再同步治疗通过调控线粒体钙单向转运体表达改善心功能的机制研究
目的：探讨心脏再同步治疗（ CRT）通过调控线粒体基质钙稳态治疗心力衰竭（心衰）的可能机制。方法通过左束支消融后右心室快速起搏4周建立心衰犬模型（ n＝6），联合心外膜电极刺激4周建立CRT治疗组（ n＝6），同时设立正常对照组（ n＝3）。在观察终点测量心功能及心肌同步性超声心动图指标；电镜下观察心肌组织线粒体超微结构改变；检测线粒体钙离子浓度变化；基因芯片筛查及多聚酶链反应（ PCR）验证线粒体钙通道相关基因表达改变。体外牵张试验进一步验证相关基因的表达情况。结果与心衰组犬相比，CRT 4周后心脏收缩同步性改善、射血分数提高。电镜观察发现心衰犬心肌线粒体肿胀、线粒体嵴断裂，正常线粒体数目减少，CRT则部分恢复了上述病理改变。基因芯片筛查发现心衰犬线粒体钙单向转运体（ mitochondrial calcium uniporter ，MCU）表达增加，同时线粒体钙离子浓度增加，而CRT可下调上述改变；提示CRT可能通过调控MCU表达调节线粒体钙稳态。同时心衰犬心肌组织中线粒体能量代谢相关酶类丙酮酸脱氢酶激酶4（ pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）的表达亦受到CRT调控而恢复正常水平。牵张试验的结果与上述结果一致。结论 CRT可能通过调节心衰心肌组织中MCU的表达，恢复线粒体基质钙稳态，影响线粒体能量代谢相关酶类的功能恢复，从而对心衰发挥治疗作用。
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无创性肢体缺血预处理对缺血心肌的保护作用
目的 验证在远距离预处理中抑制线粒体钙单向转运体对缺血、再灌注心肌的保护作用.方法 结扎冠脉左前降支使心脏局部缺血30 min,然后再灌注120 min形成缺血/再灌注损伤模型.分别应用远距离预处理、线粒体钙单向转运体抑制剂(钌红)、线粒体钙单向转运体激动剂(精胺、SB202190)进行干预.远距离预处理采用右股动脉结扎5 min,再灌注5 min,反复3个循环实现.再灌注过程中测量平均动脉压,心率,血浆乳酸脱氢酶水平,结束后测量心肌梗死面积.结果 与缺血再灌注组相比,远距离预处理使再灌注后心肌梗死面积缩小[(20.4±2.5)%比(51.0±6.0)%],乳酸脱氢酶的释放减少[(271±9)U/L比(339±39)U/L];而在远距离预处理前给予精胺或SB202190干预后梗死面积、乳酸脱氢酶降幅均减小,分别为[(40.8±9.2)%,(383±43)U/L;(44.3±6.8)%,(356±26)U/L].结论 远距离预处理通过抑制线粒体钙单向转运体的开放可以减轻缺血/再灌注对缺血心肌的损伤,起到对缺血心肌的保护作用.
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线粒体钙单向转运体参予肿瘤坏死因子α抗心肌缺血/复灌损伤的研究
目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的抗心肌缺血/复灌损伤的保护作用是否与线粒体钙单向转运体以及相关成分有关.方法:采用离体大鼠心脏灌流方法,结扎冠状动脉左前降支30 min和复灌120 min复制局部缺血/复灌损伤模型,测定心肌梗死面积、冠脉流量和冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)含量.提取大鼠心肌线粒体,分光光度法测定520 nm吸光度.结果:与单纯缺血/复灌组相比,10 U/ml TNFα预处理明显降低心脏缺血/复灌后的梗死面积和复灌期冠脉流出液中LDH含量,促进冠脉流量的恢复;复灌开始用线粒体钙单向转运体激动剂精胺(20μmol/L)灌流10 min减弱了TNFα降低梗死面积和LDH含量的作用.10 U/ml TNFα预处理离体大鼠心脏后分离线粒体,520 nm处吸光度的下降明显低于对照组;精胺(50μmol/L)减弱了TNFα对520 nm处吸光度的影响.结论:TNFα诱导的抗心肌缺血/复灌损伤的保护作用可能与其抑制线粒体钙单向转运体的开放和抑制线粒体通透性转变孔道开放有关.
关键词： 肿瘤坏死因子α 心脏 缺血/复灌 线粒体钙单向转运体 线粒体通透性转变孔道 -
线粒体钙单向转运体在远距预处理心肌保护中的作用
目的:探讨线粒体钙单向转运体是否参予远距预处理的心肌保护作用.方法:采用在体结扎冠状动脉左前降支30 min和复灌120 min复制局部心肌缺血/复灌损伤模型,采用动脉夹夹闭右下肢股动脉5 min,松开复灌5 min,共3个循环,行大鼠肢体远距预处理.结果:与单纯缺血/复灌组相比,静脉注射线粒体钙单向转运体抑制剂钌红或肢体远距预处理明显降低心脏缺血/复灌后的梗死面积(钌红组心肌梗死面积26.34%±5.4%,远距预处理组20.38%±2.50%,与单纯缺血复灌组50.96%±5.96%相比,P＜0.01)和复灌10 min血浆冠脉流出液中LDH活性[钌红组LDH活性(280.74±28.42)U/L,远距预处理组(270.5±8.91)U/L,与单纯缺血复灌组(338.75±38.60)U/L相比,P＜0.01];线粒体钙单向转运体激动剂精胺可减弱远距预处理降低心肌梗死面积(精胺+远距预处理组心肌梗死面积40.77%±9.20%与远距预处理组20.38%±2.50%相比,P＜0.01)和LDH活性[精胺+远距预处理组LDH活性(382.74±43.08)U/L,与远距预处理组LDH活性(270.50±8.91)U/L相比,P＜0.01]的作用.结论:肢体远距预处理诱导的抗心肌缺血/复灌损伤的保护作用可能与线粒体钙单向转运体的抑制有关.
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线粒体钙单向转运体在心肌低氧/复氧损伤中的作用
目的:观察线粒体钙单向转运体在心肌低氧/复氧损伤中的作用并探讨其机制.方法:应用Langendorff大鼠心脏灌流模型,低氧/复氧(H/R)采用冠脉前降支结扎30 min、复灌120 min的方法.用生物信号采集系统记录左室发展压(LVDP)、左室压大上升/下降速率(±dP/dtmax)、左室舒张末压(LVEDP);分光光度法分别检测冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量和线粒体活性氧(ROS);TTC染色法检测心肌梗死面积.结果:与单纯低氧/复氧组相比,复氧起始给予线粒体钙单向转运体抑制剂钌红(5μmol/L)明显改善左心室各项功能指标,减小心肌梗死面积,降低线粒体ROS和冠脉流出液中LDH含量;而在复氧期起始给予线粒体钙单向转运体激动剂精胺(20μmol/L),显著升高了线粒体ROS活性,冠脉流出液中LDH含量在复氧5 min、20 min、30 min时显著增多,左心室各项功能指标与心肌梗死面积与单纯低氧/复氧组相比无显著差异.ROS清除剂MPG(1 mmol/L)与精胺联合应用则取消了精胺的作用.结论:抑制线粒体钙单向转运体可能通过减少线粒体ROS的生成减轻心脏低氧/复氧损伤.
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线粒体钙单向转运体在匹鲁卡品致痫大鼠 海马神经损伤中的作用
目的 研究线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)在氯化锂-匹鲁卡品(pilo-carpine,PILO)癫痫大鼠模型神经损伤中的作用.方法 将84只雄性SD大鼠随机分成空白对照(CON)组、PILO组(2 h、8 h、24 h和72 h 4个亚组)、Ru360组和精胺(Spermine)组.观察各组大鼠行为学改变,并荧光染色法测定海马组织线粒体Ca2+浓度,TUNEL染色检测海马CA3区神经元凋亡,并采用Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C和caspase-3表达变化.结果 (1)与CON组比较,PILO组海马神经元线粒体Ca2+浓度明显升高,凋亡明显增加(P<0.05);与CON组比较,PILO组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P<0.05).(2)与PILO组比较,Ru360组海马神经元线粒体Ca2+浓度明显降低,凋亡明显减少(P<0.05);与PILO组比较,Ru360组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显减少,而Bcl-2表达水平明显增多(P<0.05).(3)与PILO组比较,Spermine组海马神经元线粒体Ca2+浓度明显升高,凋亡明显增加(P<0.05);与PILO组比较,Spermine组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P<0.05).结论 MCU在PILO癫痫大鼠海马神经损伤中发挥重要作用,抑制MCU可发挥对海马神经元凋亡的保护作用,其机制可能是通过抑制线粒体介导的细胞凋亡途径.
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线粒体钙单向转运体在β淀粉样蛋白诱导小胶质细胞凋亡中的作用机制
目的 探讨线粒体钙离子单向转运体在β淀粉样蛋白诱导小胶质细胞凋亡中的作用机制.方法 将体外原代培养小胶质细胞随机分为对照组、Aβ25-35组、Ru360组、Spermine组,并进一步采用线粒体特异性抗氧化剂MitoQ进行干预;采用流式细胞术、荧光探针及Western blotting等技术检测细胞凋亡、线粒体钙离子浓度、ROS生成及相关蛋白表达.结果 (1)与对照组相比,Aβ25-35显著增加小胶质细胞凋亡,Ru360显著减少Aβ25-35诱导的小胶质细胞凋亡,而Spermine发挥相反作用;(2)与对照组相比,Aβ25-35显著增加低线粒体钙离子浓度及线粒体ROS生成水平,Ru360显著降低Aβ25-35诱导的线粒体钙离子浓度及线粒体ROS生成水平的升高,而Spermine发挥相反作用;(3)与对照组相比,Aβ25-35组GRP78、CHOP和caspase-12的表达显著增加,Ru360显著减少Aβ25-35诱导的GRP78、CHOP和caspase-12表达的增加,而Spermine发挥相反作用;(4)与Aβ25-35组相比,MitoQ组显著减少线粒体ROS产物水平,并减少GRP78、CHOP和caspase-12表达.结论 (1)MCU在Aβ25-35诱导的小胶质细胞凋亡发挥重要作用,抑制MCU可减少细胞凋亡,而激活MCU增强细胞凋亡;(2)氧化应激介导的内质网应激反应可能在MCU参与Aβ25-35诱导的小胶质细胞凋亡中发挥重要作用.
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线粒体钙单向转运体对大鼠脑缺血/再灌注损伤线粒体分裂的影响
目的 探讨线粒体钙单向转运体(mitochondrail calcium uniporter,MCU)在大鼠短暂性脑缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)模型中对线粒体分裂的影响. 方法 将80只健康雄性Wistar大鼠采用完全随机分组法分成4组(每组20只):A组:假手术组;B组:脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)+钌红(MCU抑制剂)处理组;C组,脑I/R+精胺(MCU激动剂)处理组;D组:脑I/R组.采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MACO)模型,缺血2h再灌注24 h后对大鼠行神经行为学评分,取缺血侧脑组织测定其线粒体内钙含量、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CN)活性、线粒体分裂相关蛋白Drp1的表达量,并观察线粒体形态. 结果 与D组比较,B组钌红预处理可以改善大鼠脑I/RI引起的神经功能学障碍(1.5±0.7)(P＜0.01),降低脑缺血侧大鼠线粒体自由钙含量(265±8) nmol/L(P＜0.01),降低CN活性(0.520±0.036) U/mgprot (P＜0.01)及Drp1的表达(1.24±0.11) (P＜0.01),并减轻线粒体损伤;与D组比较,C组精胺预处理得到与钌红预处理相反的结果. 结论 MCU的开放状态可能影响大鼠脑I/RI线粒体分裂,抑制MCU开放可以抑制线粒体分裂,从而减轻大鼠脑I/RI,保护脑组织.
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线粒体钙单向转运体对大鼠脑缺血/再灌注损伤中线粒体能量代谢的影响
目的 探讨线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)活动在大鼠脑缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)中对能量代谢的影响. 方法 52只雄性Wistar大鼠按照完全随机法分为对照组(sham)、脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)组、脑缺血/再灌注复合钌红(ischemia/reperfusion +ruthenium red,I/R+RR)组、脑缺血/再灌注复合精胺(ischemia/reperfusion+ spermine,I/R+Sper)组,线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型,缺血2h,再灌注24 h后检测脑梗死面积百分比,线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ活性、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)、组织中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量. 结果 I/R组、I/R+RR组及I/R+Sper组的粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ的活性(17.67±0.21)、(6.17±0.42)、(22.29± 1.40)、(31.73±0.84) nmol·mina·mg-1,△Ψm和组织中ATP的含量(5.2±60.19)nmol/mg protein均低于sham组(P＜0.01),而这3组的脑梗死面积百分比(35.43±0.74)％和ROS含量(1 455.21±39.52) U/mg protein高于对照组(P＜0.01).钌红能够改善上述指标:与I/R组比较,I/R+RR组中的钌红能够明显提高线粒体呼吸链酶复合体的活性(22.1±70.55)、(7.50±0.15)、(36.92±2,13)、(49.32 ± 1.33) nmol· min-1· mg-1,△ Ψm和组织中ATP的含量(7.85 ±0.17) nmol/mg protein(P＜0.01),明显缩小梗死面积(26.00 ±1.71)％,降低ROS的含量(1 262.53±29.92) U/mg protein (P＜0.01)；而I/R+Sper组中的能量代谢指标则均较脑I/R组差. 结论 抑制MCU的活动可以明显改善I/RI中线粒体的能量代谢.
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线粒体钙单向转运体对线粒体通透性转换孔的调控作用
目的 探讨原代培养的新生大鼠海马神经元线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)对线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)是否有调控作用.方法 原代培养的大鼠海马神经元采用随机数字表法分为7组,每组6孔:对照组(Control组)不预先给药；精胺(spermine,Sper)组,检测时给予30μmol/L的Sper;Ru360组检测前30 min给予10 μμmol/L的Ru360;环孢菌素(ciclosporinA,CsA)组检测前30 min给予0.2 μmol/L的CsA;苍术甙(atractyloside,Atr)组检测时给予400 μmol/L的Atr;Ru360+Atr组,检测前30 min给予10 μmol/L的Ru360,检测时给予400μmol/L的Atr; CsA+Sper组,检测前30 min给予0.2μmol/L的CsA,检测时给予30 μmol/L的Sper;建立钙超载模型:各个实验组上机检测时都给予200 μmol/L的CaC12.在激光共聚焦显微镜下持续监测6 min观察各个实验组线粒体酯化钙黄绿素(calcein AM)荧光强度随着时间的变化.结果 对照组线粒体calcein AM荧光强度迅速减低(0.073±0.011)；与对照组比较,Ru360组(0.779±0.015)、CsA组(0.923±0.011)线粒体calcein AM荧光强度减低缓慢(P＜0.05)；与Sper组(0.023±0.006)比较,CsA+Sper组(0.713±0.032)线粒体calcein AM荧光强度减低缓慢(P＜0.05);Ru360+Atr组(0.643±0.087)与Atr组(0.047±0.015)比较,线粒体calcein AM荧光强度减低缓慢(P＜0.05)；与Ru360组(0.779±0.015)比较,Sper组(0.023±0.006)线粒体内calcein AM的荧光强度迅速减低(P＜0.05).结论 在体外培养的海马神经元水平上MCU对mPTP有调控作用.
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线粒体钙单向转运体在远距预处理脑保护中的作用及其机制
目的 探讨肢体缺血预处理(LIP)对脑缺血/再灌注(L/R)损伤保护作用中线粒体钙单向转运体(MCU)的作用及其作用机制.方法 将50只I/R损伤模型大鼠随机分为五组.模型组不干预,钌红组、精胺组、LIP组及LIP+精胺组分别于再灌注前予钌红、精胺、LIP及LIP+精胺干预.再灌注24h观察各组神经功能评分,血清丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)水平及脑皮质区Bcl-2阳性细胞数.结果 钌红组及LIP组神经功能评分及血清MDA、LDH水平明显低于另三组,SOD水平及Bcl-2细胞明显高于另三组,P均＜0.05.结论 CIP对I/R的脑保护作用可能与MCU有关:增强MCU活动可抑制LIP的脑保护作用.
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线粒体钙单向转运体在布比卡因加重糖尿病大鼠脊髓神经损伤中的作用
目的:探讨线粒体钙单向转运体(MCU)在布比卡因(B)致糖尿病(D)大鼠脊髓神经毒性损伤中表达的变化及其作用.方法:健康雄性SD大鼠,体重180～220 g,分为正常组与造模组,腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型后,随机选取48只,分为6组,每组8只,即鞘内注射生理盐水正常大鼠(C)组、鞘内注射生理盐水糖尿病大鼠(D)组、鞘内注射布比卡因正常大鼠(C+B)组、鞘内注射布比卡因糖尿病大鼠(D+B)组、鞘内注射10μmol/L Ru360+布比卡因糖尿病大鼠(D+R1+B)组和鞘内注射50μmol/L Ru360+布比卡因糖尿病大鼠(D+R2+B)组;各组在造模前、造模成功后、鞘内注射药物后12 h、鞘内注射药物后24 h和鞘内注射药物后48 h测定机械刺激缩足阈值(PWMT)与热刺激缩足潜伏期(PWTL)改变;测定完毕后处死大鼠,取脊髓腰膨大行RT-qPCR与Western blot测定MCU表达水平,ELISA法测定氧化损伤产物丙二醛(MDA)与8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量,TUNEL法测定脊髓神经细胞凋亡率.结果:与D组比较,D+B组MCU表达显著上调(P<0.05),PWMT、PWTL及MDA与8-OHdG含量显著升高(P<0.05),脊髓神经细胞凋亡率显著提高(P<0.05);与D+B组比较,D+R2+B组MCU表达显著下调(P<0.05),PWMT、PWTL及MDA与8-OHdG表达均显著降低(P<0.05),脊髓神经细胞凋亡率显著下降(P<0.05).结论:布比卡因通过上调MCU表达活性,增强氧化应激,加重糖尿病大鼠脊髓神经损伤与提高其机械痛与热痛阈值.
