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纯钛表面牙周韧带细胞形成物骨钙素的表达
目的:以骨钙素为细胞分化指标,探讨商用纯钛表面牙周韧带细胞形成物的特征.方法:将牙周韧带细胞和纯钛进行复合培养,分别在第8天,第16天和第24天取材,免疫荧光染色原位观察骨钙素的表达.结果:第8天后,牙周韧带细胞在纯钛表面即可形成复层生长,并持续高表达骨钙素.结论:牙周韧带细胞任纯钛表面有向成骨样细胞分化的趋势,表现为形成高度表达骨钙素的类组织.
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EGFR在人牙龈成纤维细胞和牙周韧带细胞中表达的研究
成纤维细胞是人牙龈及牙周膜中的主要细胞类型, 在维持牙龈组织的结构完整、牙周膜的更新、牙周组织损伤后的再生及牙周组织自身结构的稳定等方面具有重要作用.两种部位来源的成纤维细胞虽然形态相似, 但功能上明显不同, 目前尚无明确鉴定它们的细胞标记物.为此,我们研究了表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)在人牙龈成纤维细胞(gingival fibroblast, GF)和牙周韧带细胞(periodontal ligament cell, PDLC)中的不同表达.
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人脐带间充质干细胞诱导为牙周韧带样细胞的实验研究
目的 建立人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cell,hPDLC)与人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUCMSC)体外非接触式共培养模型,研究hUCMSC定向分化为hPDLC的可能性,探索新的可用于牙周组织工程的种子细胞.方法 利用跨室培养装置(Transwell)培养板建屯hPDLC与hUCMSC体外非接触式共培养模型,免疫组织化学方法 检测其骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(ostocalcin,OCN)及骨涎蛋白(bone sialopmtein,BSP)的表达情况,并采用蛋白质印迹法从蛋白水平定量分析诱导后hUCMSC在分子水平的改变.结果 hUCMSC在非接触式共培养体系中可以被hPDLC诱导为多角形或梭形,蛋白质印迹法检测结果 显示,共培养3、7、14及21 d后的hUCMSC在蛋白水平OCN和OPN表达上调[OCN共培养前(0.88±0.21),共培养21 d(1.42±0.17);OPN共培养前(0.93±0.13),共培养21 d(1.43±0.22)];BSP表达逐渐下调[共培养前(1.60±0.09),培养21 d(0.75±0.20)],与共培养前相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 hUCMSC在一定条件下可向hPDLC定向分化,并有望成为牙周组织工程的种子细胞.
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Scleraxis在牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞中的表达
目的 研究碱性螺旋-环-螺旋转录因子Scleraxis能否在人牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞、骨髓基质细胞中表达,及其与牙周韧带细胞分化能力的关系.方法 体外培养人牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞和骨髓基质细胞,RT-PCR法检测牙龈成纤维细胞、骨髓基质细胞及不同代次牙周韧带细胞中Scleraxis的表达.结果 Scleraxis在牙周韧带细胞、骨髓基质细胞及牙龈成纤维细胞中的表达差异有统计学意义(P＜0.05).其Scleraxis与β-肌动蛋白吸光度比值分别为0.877±0.024,0.438±0.031,0.313±0.083.Scleraxis在牙周韧带细胞中的表达强,在牙龈成纤维细胞中表达弱.牙周韧带细胞中Scleraxis的表达随培养代次的增加而减弱.结论 Scleraxis可表达于体外培养的牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞和骨髓基质细胞,Scleraxis可能在牙周韧带细胞的分化过程中起重要作用.
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细胞外基质磷酸化糖蛋白mRNA在人牙周韧带细胞成骨分化过程中的表达
目的 检测人牙周韧带细胞(periodontal ligament stem cell,PDLC)诱导矿化过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和细胞外基质磷酸化糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein,MEPE)mRNA的表达,探讨MEPE能否作为人牙周韧带细胞的分化标记及其功能.方法 酶消化法培养PDLC并鉴定其来源,取未诱导及矿化诱导7、14和21 d的PDLC,茜素红染色检测矿化结节的形成;免疫组织化学染色检测OCN的表达;实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ALP、OCN和MEPE mRNA的表达变化,并对结果进行方差分析.结果 PDLC矿化诱导后茜素红染色显示钙化结节形成,免疫染色OCN表达增强;PDLC成骨诱导培养前ALP、OCN和MEPE mRNA表达系数分别为72、1.1和534.随着诱导时间延长,ALP、OCN和MEPE mRNA表达上调,诱导7 d组的表达系数分别为78、9.56和629.6,诱导14 d组的表达系数分别为290、133和638.3,诱导21 d组的表达系数分别为1108、925和2261.1.与对照组相比,各诱导组OCNmRNA的表达、诱导14 d和21 d组ALP mRNA的表达,以及诱导21 d组MEPE mRNA的表达,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 在PDLC向成牙骨质或成骨样细胞分化过程中,MEPE mRNA与ALP和OCN呈现相似的表达变化趋势,提示MEPE与PDLC成骨分化有关,有可能作为PDLC向成牙骨质或成骨样细胞分化的标志.
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人牙髓细胞与牙周韧带细胞多向分化能力的比较
目的 比较人牙髓细胞(dental pulp cells,DPC)和牙周韧带细胞(periodontal ligamentcells,PDLC)的多向分化能力,揭示其干细胞成分特征,为开展干细胞介导的生物牙根再生奠定实验基础.方法 酶消化法分离培养人DPC和PDLC,流式细胞术检测STRO-1的表达.诱导细胞成牙本质及成骨分化、成脂分化和成软骨分化,von Kossa染色、抗骨钙素(osteocalcin,OCN)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)免疫组化染色、油红O染色、阿新蓝染色、抗Ⅱ型胶原免疫组化染色以及实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等检测DPC和PDLC的多向分化.结果 DPC和PDLC体外呈克隆样生长,STRO-1阳性率分别是(16.5%±4.2%)和(11.6%±1.1%).100%的DPC和83.3%的PDLC样本可多向分化.细胞诱导分化后,OCN、牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)、过氧化物酶体激活物增生受体2(peroxisomal proliferator activated receptorgamma 2,PPARγ2)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和Ⅱ型胶原mRNA表达上调,与诱导前相比差异均有统计学意义(P<0.001),DPC和PDLC间OCN和PPARγ2基因上调倍数的差异有统计学意义(P<0.001).结论 人DPC和PDLC的间充质干细胞比例和多向分化能力相似.
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细胞骨架及相关蛋白在人牙周韧带细胞成骨分化过程中的表达模式
目的 探讨人牙周韧带细胞(PDLCs)成骨分化过程中细胞骨架及相关蛋白的表达模式及其可能的功能作用.方法 酶消化法培养PDLCs,免疫细胞化学染色检测vimentin的表达;取诱导前(对照组)及矿化诱导7、14和21 d的PDLCs,实时荧光定量RT-PCR检测vimentin、actin、caldesmon(CaD)、tropomyosin(Tm)和 annexin A4 mRNA的表达变化并进行统计分析,Western blot检测蛋白表达.结果 PDLCs表达丰富的vimentin;Vimentin、actin、CaD和Tm mRNA的表达在诱导7 d组下调,诱导14 d组和21 d组逐渐上调;Annexin A4 mRNA的表达在诱导7 d组表现为上调,诱导14 d组和21 d组逐渐下调;Vimentin的mRNA表达在各组间差异均有统计学意义(P ＜ 0.05);CaD和Tm在诱导7 d组与14 d组之间的mRNA表达差异无统计学意义(P ＞ 0.05),其余各组间差异均有统计学意义(P ＜ 0.05);Actin和annexin A4在对照组与诱导21 d组之间的mRNA表达差异无统计学意义(P ＞ 0.05),其余各组间差异均有统计学意义(P ＜ 0.05);Western blot检测蛋白表达显示类似的表达趋势.结论 在PDLCs成骨分化过程中,一组细胞骨架及细胞骨架蛋白相关蛋白呈现相似的表达变化,提示其参与调节PDLCs成骨分化.
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RNA干扰抑制人牙周韧带细胞S100A4基因的表达
目的 研究RNA干扰技术(RNAi)下调牙周韧带(PDL)细胞中钙结合蛋白S100A4的表达,获得稳定的细胞单克隆,拟为后续试验提供细胞水平平台.方法 利用RNAi技术,针对人cDNA序列设计了S100A4干扰序列及一个阴性对照,将其连接到RNA干扰载体pGenesil-1上.转染人PDL细胞,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测有干扰序列的有效性.结果 干扰片段转染72 h后的mRNA抑制效率为67.83％.结论 RNAi可以有效抑制PDL细胞中S100A4的基因表达,为进一步研究S100A4在PDL细胞中的功能提供新的思路.
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microRNA21在人牙周韧带细胞成骨分化中的表达变化
目的：研究微小RNA21（miR21）在人牙周韧带细胞（PDLC）成骨分化早期的表达变化，探讨其对PDLC成骨分化的作用及可能的调控机制。方法培养PDLC，免疫细胞化学染色鉴定其来源。取第3～4代细胞矿化培养7、14、21 d进行碱性磷酸酶（ALP）检测，21 d进行茜素红染色；分别培养4 h和1、3、7 d，实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测miR21、靶基因萌牙2（SPRY2）和Runt相关转录因子2（RUNX2）；Western blot检测磷酸化细胞外调节蛋白激酶（ERK）1／2、磷酸化p38、SPRY2和RUNX2。对照组为正常培养细胞。结果培养的PDLC来源于间充质，7、14、21 d 的ALP活性明显增高（t7 d＝2.707，P7 d＝0.011；t14 d＝8.189，P14 d＝0.001；t21 d＝3.546，P21 d＝0.024），矿化诱导21 d茜素红染色可见矿化结节，具有成骨分化能力；实时荧光定量PCR结果显示，miR21在矿化诱导3、7 d表达上升，SPRY2的表达则呈下降趋势（FmiR21＝14.567，PmiR21＜0.05，FSPRY2＝7.765，PSPRY2＝0.004）；Western blot结果显示，ERK－丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在矿化诱导第1天始激活，而后稳步上升（t1 d＝14.378，P3 d＜0.05，t3 d＝6.558，P3 d＝0.003，t7 d＝10.685，P7 d＜0.05）；p38 MAPK信号通路活性在诱导4 h时被激活，而后与对照组活性无差异，在第7天时有所升高（t4 h＝18.803，P4 h＜0.05，t7 d＝9.643， P7 d＝0.001）。结论 miR21与PDLC成骨分化相关，其调控机制可能与ERK-MAPK、p38 MAPK信号通路相关；miR21可能靶向SPRY2调控ERK-MAPK信号通路活性，实验结果为进一步研究miR21的功能作用与调控机制提供理论依据。
关键词： 微小RNA21 牙周韧带细胞 成骨分化 丝裂原活化蛋白激酶信号通路 -
米诺环素对人牙周韧带细胞矿化能力的影响
目的探讨米诺环素对人牙周韧带细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及矿化结节形成能力的影响.方法将不同浓度的米诺环素(0,1,5,20,100,200mg/L)加入体外培养的第4代HPDLCs中,孵育4天后,检测其对细胞ALP活性的影响;将第4代的PDLCs在体外进行长期培养,实验组加入矿化液和米诺环素(20mg/L或100mg/L),对照组只加矿化液.28天后用茜素红与Von-Kossa染色检测矿化结节的形成.结果20mg/L和100mg/L的米诺环素能显提高PDLCs的ALP活性,其中20mg/L具有大的促进效应,对体外矿化结节的形成,亦有一定程度的促进作用.结论米诺环素有促进牙周韧带细胞向成骨细胞方向转化的趋势,从而有助于牙周新附着的形成.
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纯钛表面牙周韧带细胞牙骨质附着蛋白的表达
目的以牙骨质附着蛋白为分化指标,分析牙周韧带细胞在纯钛表面的分化趋势,并探讨诱导矿化对牙周韧带细胞牙骨质附着蛋白表达的影响.方法第三代牙周韧带细胞在商用纯钛表面接种后,分别进行常规培养和矿化液诱导矿化培养,通过免疫荧光原位检测牙骨质附着蛋白的表达,并比较诱导矿化对牙骨质附着蛋白表达的影响.结果牙周韧带细胞在纯钛表面初期呈条纹状生长,常规培养和诱导矿化培养条件下均能表达牙骨质附着蛋白,诱导矿化对牙骨质蛋白的表达无明显影响.结论在常规培养条件和诱导矿化培养条件下,纯钛表面生长的牙周韧带细胞能高度表达牙骨质附着蛋白,提示纯钛表面体外培养的牙周韧带细胞具有形成牙骨质的分化趋势,从而可为种植体周构建牙周韧带结构提供在种植体侧的锚着点.
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钛表面粗糙度对牙周韧带细胞早期附着影响的荧光观察
背景:种植体表面粗糙程度对组织细胞的增殖、分化及基因表达有直接影响.目的:观察牙周韧带细胞在不同纯钛表面粗糙度的早期附状态,以及材料表面性能对组织细胞分化的影响.设计、时间及地点:随机对照观察,多样本比较实验,于2005-01/2006-07在赣南医学院科研中心完成.材料:采用机床切割机将商业纯钛棒制备成直径为10mm厚2mm的钛片,共24个,分为4组:机械处理组,硝酸处理组,喷砂处理组,综合处理组,每组6个样品.方法:采用TR240便携式表面粗糙度仪测定表面粗糙度.机械处理组:进行单纯的机械处理.硝酸处理组:单纯的机械处理+65%的硝酸(100℃,1 h)处理.喷砂处理组:单纯的机械处理+100 μ m的Al2O3喷砂处理.综合处理组:单纯的机械处理+100 μ m的Al2O3喷砂处理后+65%的硝酸(100℃,1 h)处理.主要观察指标:样品在DMEM中预置30 m后接种第3代的细胞,分别于30,60,120,240 min,1,3,7 d取出钛片,于荧光显微镜下观察各组纯钛表面的粗糙度和牙周韧带细胞在不同表面粗糙度的纯钛表面早期附着情况.结果:①定量分析:4组粗糙度分别为:机械处理组(599.5±8.3)nm、硝酸处理组(406.5±4.6)nm、喷砂处理组(358.8±11.8)nm、综合处理组(8.7±2.0)nm,机械处理组高于硝酸处理组、喷砂处理组和综合处理组(P<0.01),差异有显著性意义(P<0.01).②定性分析:牙周韧带细胞在纯钛表面早期附着的荧光观察显示,随着时间的推移,各组早期附着在纯钛表面的牙周韧带细胞增多,细胞增殖良好.但粗糙度大的钛表面,细胞附着较少,粗糙度小的钛表面,细胞附着较致密些.结论:钛表面粗糙度越小,牙周韧带细胞早期附着越多,有利于细胞黏附和增殖.
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掺镁-羟基磷灰石对牙周韧带细胞的影响
目的:研究新型材料掺镁-磷灰石对牙周韧带细胞的增殖性毒性的影响,以及人牙周韧带细胞对掺镁-羟基磷灰石的黏附性的研究.方法:用体外方法培养人牙周韧带细胞,将不同浓度的掺镁羟基磷灰石(5%Mg-HA,10%Mg-HA)分别与牙周韧带细胞共同培养.对照组为自固化磷酸钙(CPC),羟基磷灰石(HA),玻璃离子(GIG)浸提液组.采用MTT法检测细胞毒性以及增殖率.细胞核进行DAPI 染色,观察细胞对掺镁羟基磷灰石的黏附情况.结果:MTT检测结果表示为细胞增殖率自固化磷酸钙>5%掺镁羟基磷灰石>10%羟基磷灰石>羟基磷灰石>玻璃离子,各组比较具有显著统计学意义.(P<0.05)每组材料20g/L、40g/L、80g/L浓度之间无统计学意义(P>0.05).人牙周韧带细胞对材料有一定的黏附性.结论:掺镁羟基磷灰石对牙周韧带细胞有良好的生物相容性,毒性小,有一定的促进牙周韧带细胞黏附作用.为髓室底穿,根管侧穿的修复工作提供了新的选择.
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维A酸对体外培养的人牙周韧带细胞的生物学作用
目的:探讨维A酸对体外培养的人牙周韧带细胞的生物学作用.方法:体外培养人牙周韧带细胞,分别以不同浓度的维A酸作用于细胞,在倒置显微镜下观察不同浓度的维A酸对细胞形态与排列的影响;并通过MTT法、酶动力学方法及考马斯亮蓝法检测维A酸对细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性及蛋白质合成的影响.结果:维A酸能增强牙周韧带细胞的碱性磷酸酶活性,10-6mol/L浓度的维A酸对细胞的作用效果明显(P＜0.01);而对细胞形态与排列、增殖能力及总蛋白合成无影响.结论:维A酸可促进牙周韧带细胞向成骨样细胞方向分化.
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牙周韧带细胞在商用纯钛表面生物学行为的实验研究
目的采用形态学、计量学和免疫组织学方法,观察牙周韧带细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)在商用纯钛(commercially pure titanium,cpTi)表面的附着和分化特征,探讨牙种植体与PDLCs之间的界面关系.方法PDLCs在cpTi表面接种后,分别采用荧光显微镜、扫描电子显微镜观察细胞的附着形态,MTT法分析细胞粘附,免疫荧光观察细胞骨钙素(osteoclin,OC)的表达.结果PDLCs在cpTi边缘逐步伸展,扫描电子显微镜示细胞呈长梭形,并逐渐以"伪足"沿cpTi表面伸展;荧光显微镜显示,细胞附着早期有多种附着相;细胞计数显示,细胞数量在2h后趋于稳定,4 h内持续增加.7 d后细胞形成与cpTi打磨方向一致的单层.细胞及基质成分中表达0C.结论PDLCs在cpTi表面的粘附过程有一定的规律性,细胞的早期附着是一个动态过程,附着后期具有矿化趋势.
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Ⅰ、Ⅲ型胶原在牙龈成纤维细胞和牙周韧带细胞中表达的比较研究
目的比较人牙龈成纤维细胞与牙周韧带细胞在胶原基质合成方面的差别,并探讨其意义.方法采用组织块法体外培养人牙龈成纤维细胞与牙周韧带细胞,利用免疫细胞化学技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原在两种细胞中的表达,通过图像分析探讨其表达的差异.结果Ⅰ、Ⅲ型胶原在牙周韧带细胞中表达阳性,在牙龈成纤维细胞中染色较弱.统计学分析显示,Ⅰ、Ⅲ型胶原在牙龈成纤维细胞与牙周韧带细胞的免疫细胞化学染色结果具有显著性差异(P＜0.01).结论牙龈成纤维细胞与牙周韧带细胞胶原基质的合成或分泌存在差异,这种差异可作为鉴别两种细胞的标志之一.
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定点时段高分压氧对体外培养的人牙周韧带细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响
目的 探讨高分压氧(high partial pressure oxygen,HPPO)对体外培养的人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)增殖和分化的影响,为高压氧(HBO)辅助治疗促进牙周组织修复再生提供研究基础和理论依据.方法 组织块法体外培养hPDLCs,定点分别以不同分压的HPPO对hPDLCs处理不同时间,观察细胞形态;通过四唑盐比色法(MTT)和酶动力学方法,动态观察HPPO对hPDLCs增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响.结果 在定点时段HPPO处理后hPDLCs增殖明显,形态良好;下列方案HPPO处理能显著促进hPDLCs的增殖,提高其ALP活性(P＜0.05或P＜0.01):100kPa-2 h/d、200 kPa-1 h/d、400 kPa-30 min/d和600 kPa-30 min/d.下列方案处理后,作用相反(P＜0.05或P＜0.01):100 kPa-6 h/d、200 kPa-4 h/d、400 kPa-4 h/d和600 kPa-2 h/d.结论 一定量的HPPO可以促进体外培养的hPDLCs的增殖和分化,HBO辅助治疗可能是促进牙周组织愈合和再生的有效方法之一.
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重组腺病毒载体 Ad5-hOPG-EGFP介导 hOPG基因在犬牙周韧带细胞中的表达检测
目的：观察人骨保护素（human osteoprotegerin，hOPG）在犬牙周韧带细胞（periodontal ligament cells，PDLCs）中的表达情况，为后期的牙周组织再生实验制备高表达目的基因hOPG的种子细胞。方法：体外构建携带hOPG基因的腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP，并将其转染Beagle犬PDLCs，通过流式细胞术、实时定量RT-PCR、ELISA以及Western Blot检测目的基因的转录和表达。结果：重组腺病毒Ad5-hOPG-EGFP成功转染犬PDLCs，转染72 h后转染效率达到80％以上，转染的细胞发出较强的绿色荧光；基因和蛋白水平检测表明，hOPG在犬PDLCs中得到了有效表达。结论：重组腺病毒介导的hOPG基因可以在PDLCs中有效表达。
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表没食子儿茶素没食子酸酯对人牙周韧带细胞增殖作用的研究
目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯 (epigallocatechin gallate,EGCG)对人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cells,hPDLC)体外培养是否存在增殖作用.方法 在体外培养的hPDLC中分别加入50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml和800 μg /ml不同浓度的EGCG作为实验组,对照组在普通培养基中培养.两组均在孵育24 h、48 h、72 h后通过MTT法测定细胞增殖情况.结果 在各时间段中,50 μg/ml浓度组细胞的吸光度与对照组相比无明显差异(P>0.05),100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml和800 μg/ml 4个浓度EGCG组细胞的吸光度较高,显著高于对照组(P<0.05).说明EGCG对人牙周韧带细胞的小显效浓度是100 μg/ml,在100~800 μg/ml浓度范围内可明显促进hPDLC的增殖活动.结论 EGCG对hPDLC的增殖具有明显的促进作用.
关键词： 没食子儿茶素没食子酸酯 牙周韧带细胞 细胞增殖 -
牙龈成纤维细胞与牙周韧带细胞在二种玻璃离子水门汀上附着及增殖的比较
目的比较人类牙龈成纤维细胞(HGF)与牙周韧带细胞(PDLC)在两种玻璃离子水门汀(GIC)上的附着及增殖情况. 方法利用体外细胞培养技术及3H-TdR掺入法检测HGF及PDLC在两种GIC上的附着及DNA合成. 结果 HGF与PDLC在培养板上的附着及DNA合成差异无显著性(P>0.05),但HGF在GIC上的附着及DNA合成明显强于PDLC(P<0.05). 结论 Ketac Fil 和Fuji Ⅱ可能是临床修复龈下根面缺损的较好材料,但在相同条件下,HGF较PDLC可能有更强的生长能力.
