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百日咳杆菌毒素S1亚单位突变体的研究进展
百日咳杆菌毒素(PT)是目前无细胞百日咳疫苗中的主要保护性成分,其中PT的S1亚单位又是其主要的功能性亚基,具有免疫保护活性和多种毒性.在对多个S1突变体的生物学及免疫学研究后发现,其中的一个S1的双位点突变体(PTX-9K/129G)在保持有良好的免疫原性和免疫保护作用的基础上,大大降低了PT的毒性,有望成为理想的百日咳疫苗候补抗原.
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百日咳毒素S1亚单位缺失分子的构建及其在重组杆状病毒中的表达
目的:为探明羧基端疏水区对百日咳毒素S1亚单位分泌性的影响,试图构建缺失羧基端疏水区的S1亚单位.方法:应用PCR技术构建了6种不同信号序列修饰的缺失羧基端疏水区的S1亚单位编码基因,并使用重组杆状病毒(rBV)技术实现了这些缺失S1亚单位(tS1)在昆虫细胞中的高水平表达.结果:这些缺失S1亚单位的表达量为每万个昆虫细胞1.01～2.25 μg.细菌信号肽和流感病毒HA信号肽均能完整表达和正确剪切,但HA信号肽在昆虫细胞中的处理效率更高.结论:tS1亚单位缺失羧基端疏水区后在昆虫细胞中的表达量明显提高,这些tS1亚单位的异源性表达是由于信号肽剪切不全所导致,tS1分子表观分子量的漂移并不意味着信号肽剪切不正确.
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百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化
目的 克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性.方法 采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段.将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达.表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 PCR及重叠延伸获得了约700 bp的目的 基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27 000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应.结论 成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础.
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百日咳毒素S1亚单位截短片段的表达、纯化及初步应用
目的 表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建市榆测PT的双抗体夹心ELISA法.方法 PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用镍离子亲和层析柱纯化,复性后的蛋白免疫家兔,制备抗血清,纯化后作为包被抗体,建立检测PT的双抗体夹心ELISA法,并检测其特异性.结果 表达的重组蛋白相对分子质量约为19 000,主要存在于破菌沉淀中,表达量占菌体总蛋白的44%;纯化后蛋白纯度为94.5%;家兔抗血清可特异性识别天然PTSI;建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好.结论 已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146,并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体,初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法,为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础.
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百日咳毒素S1亚单位的表达及其免疫原性研究
目的研究百日咳毒素S1(Pertussistoxin S1 subunit)亚单位在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性.方法采用PCR法从百日咳杆菌染色体中获得S1亚单位的结构基因并克隆到质粒pCR2.1-TOPO中,转化宿主菌DH5α和TOP010.用抗S1的单抗1B7检测表达产物.用粗制的重组S1(rS1)免疫小鼠,做主动免疫保护实验.rS1免疫家兔,检测rS1的免疫原性.并以家兔免疫血清在小鼠进行被动免疫保护实验.结果rS1可在大肠杆菌中稳定高效表达,表达量分别占细胞总蛋白量的14%(DH5α)和24.2%(TOPO10).rS1能被1B7识别,在小鼠主动免疫实验中,保护率可达56.3%.家兔免疫血清ELISA效价为1:32 000.抗rS1血清对小鼠被动的免疫保护率为100%.结论rS1具有良好免疫原性,为百日咳基因工程疫苗或亚单位疫苗研制及百日咳免疫机理研究提供了依据.
