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使用沃特世超高效合相色谱分析短杆菌肽
短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质,被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素.用反相液相色谱(RPLC)分析疏水性肽和蛋白质难度很大.因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性,而这些洗涤剂容易发生聚集或沉淀,严重影响它们的回收,这些因素及其他原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质.在ACQUITY UPC2 TM系统上使用沃特世(Waters(R))超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法,可得到线性和可重复的结果,测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4％,是准确、高精度分析短杆菌肽的方法.
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应用胶体金免疫层析技术建立炭疽杆菌芽孢的快速检测方法
[目的]建立1种炭疽杆菌芽孢的快速检测方法.[方法]利用胶体金免疫层析技术,采用双抗体夹心法检测炭疽芽孢杆菌,对该方法进行特异性、敏感性等评价;在面粉、淀粉、奶粉等材料中掺入炭疽疫苗株芽孢模拟"白色粉末",评价该法检测炭疽生物恐怖和环境样品的可行性.[结果]该法能在20min内完成检测,多种不同的芽孢菌及其它菌检测评价显示该法特异性良好,检测灵敏性为1×106cfu/ml,环境样品的检测敏感性也相同.[结论]建立的检测炭疽芽孢杆菌的胶体金免疫层析方法,能快速、特异、灵敏的检测炭疽芽孢,适用于现场的快速检测.
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悬浮芯片法与生物素-亲和素ELISA法检测炭疽杆菌芽孢比较研究
[目的]建立快速、敏感、特异、高通量、同时检测多种病原体的技术方法.[方法]建立基于双抗体夹心免疫学检测的编码微球悬浮芯片和生物素-亲和素ELISA方法,比较2种方法对炭疽芽孢杆菌定量检测以及直接从"白色粉末"样品中检测的能力.[结果]悬浮芯片对炭疽杆菌芽孢检测具有很好的敏感性和特异性,低检出限为4.2×103cfu/ml,动态范围为103～107cfu/ml;生物素-亲和素ELISA低可以检测到1.4×104cfu/ml,线性范围为104～107cfu/ml.[结论]悬浮芯片方法检测炭疽杆菌芽孢比ELISA方法具有更高的灵敏度和更宽的动态检测范围,在病原菌的早期识别、快速诊断、应对生物恐怖威胁、控制传染病爆发中具有广阔的应用前景.
关键词： 悬浮芯片 生物素-亲和素ELISA 芽孢杆菌 炭疽 定量检测 -
一起蜡样芽孢杆菌污染学生营养午餐造成食物中毒的调查
2000年10月26日一学生营养餐生产企业向17所中小学供应营养午餐,其中5所小学同时发生食物中毒.5所小学1 658名学生进食,84人发病,发病率为1.5%.主要症状为腹痛、腹泻,潜伏期6～22 h,中位数17 h.根据流行病学调查、临床表现、实验室检验结果分析,认为这是一起由Ⅱ型蜡样芽孢杆菌引起的细菌性食物中毒,可疑食品为加到26日午餐中的25日剩下的土豆烧牛肉和烩豆腐.经对症治疗后,全部病人症状缓解,预后良好,无危重病人和死亡病例.
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四联活菌肠溶胶囊治疗36例慢性腹泻临床效果观察
目的 研究证实双歧杆菌、肠球菌、乳杆菌和芽孢杆菌四联活菌肠溶胶囊治疗慢性腹泻的临床效果.方法 选取慢性腹泻患者70例,随机分为两组,治疗组36例,效用四联活菌肠溶胶囊进行治疗,对照组34例,采用诺氟沙星进行治疗,疗程14d.统计观察治疗后两组患者腹泻缓解时间和临床症状的变化以及治疗效果.结果 治疗后第14天治疗组临床症状改善情况与对照组相比有显著性差异;疗程结束时治疗组腹泻缓解率为86.1%(31/34),大便成形率为77.8%(28/36),腹泻伴随症状下降效果明显由于对照组.结论 采用双歧杆菌、肠球菌、乳杆菌和芽孢杆菌四联活菌肠溶胶囊治疗慢性腹泻患者,具有安全有效、无明显不良反应.
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乙醇消毒液污染调查及其杀菌效果观察
目的 了解医院使用中的75%乙醇污染状况,观察乙醇消毒液杀菌效果.方法 采用采样检测法和稀释法进行检测.结果 使用中的75%乙醇消毒剂细菌超标率为8.1%,从中检出解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌.乙醇对14种细菌繁殖体的低杀菌浓度为10%～25%.5%～95%乙醇消毒液对蜡样芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌均无杀灭作用.结论 75%乙醇消毒液对细菌繁殖体杀灭效果好,对芽孢杆菌无杀灭作用,易受到芽胞杆菌的污染.
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基于上转发光免疫层析技术的鼠疫耶尔森菌、炭疽杆菌芽孢、布鲁菌快速检测方法研究与对比评价
目的 研制基于上转发光免疫层析技术(UPT-LF)检测鼠疫耶尔森菌(简称鼠疫菌)、炭疽杆菌芽孢、布鲁菌的试纸,与BioThreat Alert(R)免疫层析(BTA)试纸的检测和操作性能进行对比.方法 以上转发光纳米颗粒作为生物示踪物,采用双抗体夹心模式分别研制检测鼠疫菌、炭疽杆菌芽孢、布鲁菌的UPT-LF试纸.分别配制1010、109、108、107、106、105、0 CFU/ml系列浓度的鼠疫菌、炭疽杆菌芽孢、布鲁菌标准品以及109 CFU/ml系列浓度的27种特异性评价菌株菌液,采用UPT-LF试纸对其进行检测,对3种UPT-LF试纸的敏感性、精密性、线性和特异性进行分析评价.配制模拟阳性样品,分别采用UPT-LF和BTA试纸对107、106、105、0 CFU/ml系列浓度的标准品以及模拟阳性样品进行检测,比较UPT-LF和BTA试纸的检测时间、敏感性以及鼠疫菌、炭疽杆菌芽孢、布鲁菌的检出率.结果 鼠疫菌UPT-LF、炭疽杆菌芽孢UPT-LF、布鲁菌UPT-LF试纸的敏感性均达到105 CFU/ml,各系列浓度检测带信号/质控带信号(T/C)值的变异系数均≤15％,lg[T/C值-临界值(cut-off值)]与lg(标准品浓度)的相关系数分别为0.996、0.998、0.999(F=1 647.57、743.51、1 822.17,P值均＜0.001).鼠疫菌UPT-LF和布鲁菌UPT-LF试纸检测特异性评价菌株时,均无非特异性交叉反应,炭疽杆菌芽孢UPT-LF试纸检测枯草芽孢杆菌分离株2#芽孢、蜡样芽孢杆菌分离株l#芽孢存在非特异交叉反应,检测其他特异性评价菌株均无非特异性交叉反应.UPT-LF试纸检测鼠疫菌、炭疽杆菌芽孢、布鲁菌样品的时间分别为33、36、37 min,BTA为115、115、111 min;UPT-LF和BTA试纸检测0 CFU/ml标准品的阴性率均为5/5;UPT-LF试纸检测炭疽杆菌芽孢、鼠疫菌、布鲁菌的敏感性均达到l05 CFU/ml,BTA试纸分别为106、106、105 CFU/ml;模拟样品检测中,UPT-LF试纸炭疽杆菌芽孢、鼠疫菌、布鲁菌的检出率均为16/16,BTA试纸分别为7/16、16/16、16/16.结论 UPT-LF试纸检测鼠疫菌、炭疽杆菌芽孢、布鲁菌的敏感性较高,特异性、线性和精密性较佳,检测和操作性能较BTA试纸更为优良.
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芽孢杆菌发酵炮制中药红花增强溶血栓药效研究
目的:探讨芽孢杆菌发酵炮制中药红花增强溶血栓药效.方法:采用系统数值化和数值系统调控技术对发酵炮制条件进行合理适量优化,用角叉菜胶法对小鼠尾部进行了血栓实验,检测了大鼠纤溶和凝血指标.结果:在相同剂量下(1000 U/mL)A红发组(红花与C2-13共发酵组)比其余各组有明显缩短血栓长度(P＜0.05),凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)以及活化的部分凝血活酶时间(APTT)被延长,明显缩短优球蛋白溶解时间(ELT)的作用(P＜0.05).结论:红花通过C2-13菌种发酵炮制后可有效提升纤溶活性、抗凝作用,增大溶血栓的药效.
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芽孢杆菌发酵炮制中药红花增强溶血栓药效研究
目的:利用具有高纤溶酶活性的地衣芽孢杆菌C2-13发酵炮制中药红花以增强整体溶血栓药效的研究.方法:应用系统数值化及数值系统调控技术对发酵炮制条件进行优化,用角叉菜胶法进行了小鼠尾部血栓实验及测定了大鼠纤溶及凝血指标.结果:在同等剂量下(1 000 U·mL-1)A红发组(红花与C2-13共发酵组)比其余各组均有缩短血栓长度(P<0.01);明显延长凝血酶原时间(PT)(P<0.05)、凝血酶时间(TT)(P<0.05)和活化的部分凝血活酶时间(APTT)(P<0.01) ;显著缩短优球蛋白溶解时间(ELT)(P<0.01)的作用.结论:红花通过C2-13菌种发酵炮制后可提高纤溶活性、抗凝作用,增强溶血栓药效.
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表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白枯草芽孢的免疫原性
目的 构建表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)的重组枯草芽孢,并鉴定其免疫原性.方法 以构建的pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,采用特异性引物扩增幽门螺杆菌NAP基因,与构建的以枯草芽孢外衣蛋白Cotc融合表达的质粒Pus186-Cotc连接,转化枯草杆菌WB600,提取质粒进行酶切、测序鉴定.应用营养耗竭法诱导枯草芽孢生成,提取重组芽孢外衣蛋白进行电泳及免疫印迹分析,并使用NAP特异性抗体免疫荧光检测芽孢表面重组蛋白的表达.以普通芽孢作为对照组,使用表面表达NAP的重组枯草芽孢口服免疫小鼠,ELISA法检测小鼠免疫后0、15、30、45 d的NAP特异性血清IgG水平,判断重组芽孢免疫原性.结果 以pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,扩增了NAP基因,并成功克隆入Pus 186-Cotc质粒,重组Pus 186-Cotc-NAP双酶切鉴定可见435 bp目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中.营养耗竭法可诱导重组枯草芽孢生成,产量达1×1011/L,提取芽孢外衣蛋白电泳见相对分子质量25 600的目的条带.免疫印迹显示使用NAP特异性抗体在相应相对分子质量25 600可见识别带.并且使用NAP特异性抗体可检测到重组芽孢免疫荧光,表明NAP在芽孢表面成功表达.与对照组相比,NAP重组芽孢口服免疫小鼠15d后,NAP特异性IgG升高即达高峰,30、45 d后一直维持在高峰平台期(均P＜0.05),表明重组芽孢具免疫原性.结论 成功构建了表面表达NAP的枯草芽孢工程菌,重组芽孢口服免疫小鼠具免疫原性,为幽门螺杆菌枯草芽孢疫苗的研制提供了依据.
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消除新生儿破伤风的免疫策略
1 新生儿破伤风的发病机理及诊断新生儿破伤风(NNT)是由破伤风芽孢杆菌引起的死亡率高的疾病.破伤风芽孢杆菌是土壤中常见的菌群之一,从土壤标本中20%～47%可分离到破伤风芽孢杆菌,人与动物粪便中也含该菌,马粪中破伤风芽孢杆菌检出率为8%～30%.
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医学昆虫微生物杀虫剂的研究进展
杀虫微生物是指可导致宿主虫致病或死亡,或其代谢产物可直接杀死虫体的微生物.目前已知的杀虫微生物约有3 000种,其中用于防治害虫的微生物或其产物叫微生物杀虫剂,包括活化微生物杀虫剂及微生物源杀虫毒素、抗生素.活化微生物杀虫剂以及来源于芽孢杆菌、放线菌等的杀虫毒素都已经进入分子水平的研究,而且新的杀虫病原不断被发现,毒力强的病原不断被筛选和改造,编码强毒力毒素的基因被发现,并成功的转入藻类等多种载体中.目前这类杀虫剂已在医学昆虫的防治中得到应用.本文仅就与医学昆虫相关的微生物杀虫剂的研究进展综述如下.
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灭蚊幼芽孢杆菌剂型的研究与应用
目的针对蚊虫的生态习性和不同孳生地特点,研制具有即效又有持效的灭蚊幼芽孢杆菌剂型.方法选用漂浮剂锯末粉为载体,加粘附剂和分散剂,按一定比例制成不同剂型进行灭蚊幼试验,并观察不同剂型对哺乳动物、非靶生物的影响.结果Bti-187颗粒剂,稻田灭中华按蚊幼虫持效为12～16 d,块剂在小型孳生地灭致倦库蚊和白纹伊蚊幼虫,持效分别可达17和12 d,BS-C3-41颗粒剂、块剂灭致倦库蚊幼虫持效分别可达19和94 d.Bti-187和BS-C3-41发泡剂有较好的即效,48 h灭蚊幼效果达100%,持效分别可达15和21 d.结论针对不同蚊虫孳生地特点,采用不同剂型配合使用,蚊虫密度平均下降70%～100%.能有效控制成蚊密度,削平成蚊季节高峰.
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重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建和分泌表达
目的 构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌及其目的 蛋白的分泌表达,并对其酶活性进行测定.方法 从 pET-22b/pUOX 重组质粒上 PCR 获得 pUOX基因,然后通过重叠延伸 PCR 技术将 pUOX 与一段 nprB信号肽基因相连,导入穿梭载体 pP43X,构建重组载体pP43X/pUOX,运用化学转化法转化枯草芽孢杆菌 WB800中.结果 发酵表达后胞外分泌液经 SDS-PAGE 检测,在约34 kD 处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致.发酵液中该重组蛋白的酶活力达 2.322 U/ml.结论 成功构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌,目的 蛋白分泌表达并具有较高活性.
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罗布泊来源胀果甘草根际枯草芽孢杆菌GA21次生代谢产物结构与活性初步研究
目的 分离鉴定枯草芽孢杆菌GA21发酵液中次生代谢产物并对其活性进行初步研究.方法 采用TLC、HPLC等分离手段对次生代谢产物进行分离；通过HR-ESI质谱、1D-NMR和2D-NMR对其结构进行鉴定；以琼脂平板法检测其次生代谢产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、稻瘟菌、白色念珠菌的拮抗活性.结果 分离得到两个异香豆素类次生代谢产物:GA21-20和GA21-26；其中GA21-20的化学结构与Amicoumacin B一致,但无抗细菌及真菌活性；GA21-26有抗真菌活性,但无抗细菌活性,分子量为435.20890,分子式为C21H29O7N3,是一新的3,4-二氢异香豆素类抗生素.GA21-26在2.5 μg/纸片对白色念珠菌即可显示抑制活性,在80μg/纸片对水稻稻瘟菌显示抑制活性,表明GA21-26在拮抗医学条件致病真菌方面有潜在用途.结论 枯草芽孢杆菌GA21能产生一系列3,4-二氢异香豆素类抗生素,其次级代谢产物值得进一步研究.
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炭疽PA和芽孢双组分候选疫苗免疫豚鼠的免疫学初步评价
目的 对豚鼠免疫重组PA抗原和甲醛灭活芽孢组成的炭疽候选疫苗,评价其免疫效果.方法 将豚鼠随机分成5个实验组,分别免疫高、中、低剂量候选疫苗、炭疽活疫苗或生理盐水;免疫后不同时间点采血进行抗体检测、XTT法淋巴细胞增殖检测以及皮肤迟发型超敏反应检测.结果 抗体检测结果显示,双组分炭疽候选疫苗能诱导较强的体液免疫应答;XTT细胞增殖结果显示,外周血淋巴细胞特异性增殖不明显,但所有候选疫苗组针对rPA DTH阳转率24 h后均为100％.结论 双组分炭疽候选疫苗能诱导豚鼠产生体液免疫和细胞免疫应答.
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应用枯草芽孢杆菌表达系统制备肠道病毒71型VP1蛋白
目的 利用枯草芽孢杆菌系统表达肠道病毒71型(EV71)病毒VP1蛋白.方法 使用基因特异性引物扩增VP1开放读码框(ORF),构建包含VP1完整开放读码框的pSac-VP1穿梭载体.根据枯草芽孢杆菌表达系统双交叉同源重组的特点,将EV71的结构抗原基因VP1整合在枯草芽孢杆菌sacA染色体,并经测序鉴定.使用VP1特异性抗体,通过蛋白印记(Western-Blot)鉴定枯草芽孢杆菌中VP1蛋白的表达情况.结果 成功克隆EV71的VP1基因,长度1361 bp,并将其克隆入穿梭载体pSac-Kan.测序结果显示VP1基因成功整合如sacA染色体.Western-Blot证实VP1抗原在枯草芽孢杆菌的成功表达,相对分子质量约35×103.结论 利用枯草芽孢杆菌表达系统成功制备EV71病毒VP1抗原,为后续EV71诊断试剂、疫苗研发奠定基础.
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基于枯草芽孢杆菌系统制备的EV71 VP1重组抗原诱导小鼠免疫应答的研究
目的 观察基于枯草芽孢杆菌系统制备的EV71 VP1重组抗原诱导BALB/c小鼠产生的免疫应答反应.方法 通过建立BALB/c小鼠动物模型,分别将前期构建的基于枯草芽孢杆菌系统制备的EV71重组抗原(rVP1)、灭活EV71病毒免疫组(EV71)和空白对照组(PBS),经鼻腔接种6～8周龄BALB/c小鼠,ELISA方法检测免疫后不同时间产生的特异性IgG、IgA以及IgG1和IgG2a水平.结果 EV71重组抗原可以有效诱导小鼠产生高水平的体液免疫和明显的黏膜免疫应答,且能够诱发均衡的Th1、Th2免疫调节.结论 肠道病毒71型重组VP1抗原可诱发小鼠产生明显的特异性体液免疫和黏膜免疫应答.
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海洋弧菌鉴定方法学评价
近年来，由海洋细菌导致的感染越来越常见，弧菌是海洋细菌中常见的类群之一，可引起人类腹泻、菌血症及外伤感染，严重时可导致死亡。目前，对海洋弧菌尚缺乏快速可靠的鉴定方法。16S rRNA 序列分析目前被公认为细菌鉴定的金标准。然而由于海洋细菌进化缓慢，且基因具有高同源性，16S rRNA 测序并不能对海洋弧菌进行可靠鉴定。编码 RNA 聚合酶β亚基的基因 rpoB 为序列较长的单拷贝基因，可以克服16S rRNA 的高度保守性。至今为止，许多研究已经证明 rpoB 基因可用于各种细菌的分类，包括芽孢杆菌、军团菌、分枝杆菌、葡萄球菌等［1］。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（ matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/ TOF MS）技术是近年发展起来的一种全新的用于微生物快速鉴定的技术，具有快速、稳定、准确、重复性好的特点。为促进海洋弧菌的快速可靠鉴定，本研究利用16S rRNA 测序、rpoB 测序和MALDI- TOF/ TOF MS 3种技术对128株海洋弧菌同时进行鉴定，对比分析检测结果并进行方法学评估。
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从一例多细菌协同性坏疽的标本中分离到罕见芽孢杆菌
目的 确定从一例多细菌协同性坏疽患者临床标本中分离的、使用常规方法不能够鉴定的YP菌株的分类学位置.方法 使用16S rRNA序列分析和同源性检索方法,及细菌的形态学和生化反应鉴定方法.结果 YP菌株为革兰氏阳性杆菌,可在厌氧和有氧条件下生长,在LB琼脂上有氧条件下培养48h后产生端生芽孢.触酶阳性,无动力,硝酸盐还原.在PYG肉汤中的代谢产物主要为乙酸、乳酸以及少量的琥珀酸和异戊酸.G+C mol%为33.16S rRNA 序列分析和同源性检索发现YP 和芽孢杆菌一些种的同源性较高,可达96%.但和已经发表的芽孢杆菌属的细菌种有明显区别.结论 YP菌株在分类学上应该属于芽孢杆菌属,但是和芽孢杆菌属已经发表的种都不相同,可能是一个新种.
