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人RAG2基因5'近端染色质结构定量差异分析及可接近区域转录调控机制研究
目的 研究人类重组激活基因2(RAG2)5’近端染色质可接近区域调控RAG2表达的分子机制.方法 采用染色质可接近性实时聚合酶链反应(CHART-PCR)分析RAG2基因5’近端区域的DNase Ⅰ超敏位点(DHS),比较RAG阳性和阴性淋巴细胞以及非淋巴细胞的染色质开放状态变化.采用双荧光素酶报告基因分析DHS的转录调控活性,采用胶迁徙试验和染色质免疫沉淀试验证实GATA3的体外(in vitro)和在体(invivo)结合,采用PCR定点突变和显性负突变体技术证实GATA3对RAG2基因的调控作用.结果 人RAG2基因5’上游近端区域染色质在T与B细胞中处于不同的开放状态,RAG阳性T细胞的核心启动子活性与其特异性DHS相吻合.T细胞特异性转录因子GATA3结合于T细胞特异性DHS的高度保守区域,特异性上调报告基因及在体RAG2 mRNA在T细胞中的表达.结论 RAG2基因5’近端区域通过染色质开放状态变化调控基因表达的特异性.GATA3与高度保守的DHS区域结合,上调内源性人RAG2在T细胞中的表达.
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固有淋巴细胞3型与人类免疫缺陷病毒-1感染
近年来，科研人员在黏膜部位发现一些新细胞群，这类细胞具有3个主要的共同特征：没有重组激活基因（RAG）依赖的重排抗原受体，缺乏髓系细胞和DC细胞的表型分子，具有淋巴细胞的形态［1］；因此，这群细胞被命名为固有淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILCs）。ILCs的前体细胞位于胎鼠的肝脏和成年鼠的骨髓［2］，其发育和维持需要细胞因子共用受体γ链［γc，白细胞介素（IL）-2Rγ］、DNA结合抑制因子2（Id2）和IL-7受体α亚单位［3］。ILCs是固有免疫的重要效应细胞，其功能主要表现在淋巴器官的形成和组织重塑；近来研究表明，ILCs亚群在抗微生物免疫的早期阶段具有重要的效应功能［4，5］，其还能帮助组织修复，共生细菌的控制和上皮完整性的维持。ILCs缺乏特异性抗原受体，但能产生一系列细胞因子来实现其效应功能。值得注意的是，ILCs细胞与辅助T细胞亚群类似，具有差异化的细胞因子分泌模式［6］。如部分ILCs细胞被刺激后能分泌Th17细胞相关的细胞因子IL-17和IL-22，而一些细胞亚群被刺激后分泌Th2细胞相关的细胞因子IL-5和IL-13［6］。
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重组激活基因突变与免疫缺陷病表型多样性
重组激活基因( recombination activating gene,RAG)突变导致一系列严重的免疫缺陷病,包括重症联合免疫缺陷( severe combined immunodeficiency,SCID)、Omenn综合征以及多种其他特殊表型。不同患者因RAG分子表达受影响程度的差异而表现出复杂多样的免疫表型、组织病理学改变和临床表现。RAG完全缺陷分为典型SCID和母源T细胞输入型SCID。 RAG残留缺陷包括典型Omenn综合征、非典型Omenn综合征、肉芽肿性炎症、γδ T细胞优势扩增型以及母源T细胞植入。患者的淋巴细胞分化发育受到完全或者部分阻断,导致反复感染,并且常伴随自身免疫反应,严重威胁生命。该文对RAG免疫缺陷的各种复杂表型进行归纳,为该疾病的正确诊断、针对性治疗以及发病机制研究提供参考。
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076 重组激活基因研究进展
重组激活基因(RAGs)的编码产物Rag1和Rag2组成重要的重组酶,能特异地识别Ig和TCR的V、DH、J基因片段两侧的RSS,并催化DNA双链断裂,引起V(D)J重排,是Ig和TCR库多样性的主要原因.RAGs在体内和体外激活的成熟B细胞中也能被诱导表达,在斑马鱼的嗅觉神经元中检测到第一例非淋巴组织中的RAGs共表达.
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人T细胞白血病细胞株Jurkat的TCR基因重排
背景与目的:近年的一些体外实验研究发现,重组激活基因(recombination activating gene)编码的RAG1与RAG2(recombination activating genes,RAGs)蛋白能够介导DNA链的转位(transposition)作用,因而,可能与淋巴系统肿瘤性疾病的发生有关,但迄今尚未有明确定论.我们在实验中发现,代表T细胞发育成熟阶段的人白血病细胞株Jurkat同时表达重组激活基因RAG1和RAG2,并且经适当诱导后有RAGs表达的变化.本研究旨在确证Jurkat细胞是否发生RAGs介导的T细胞受体(T-cell receptor,TCR)基因重排.方法:采用巢式和半巢式PCR检测T细胞受体Dβ-Jβ之间的信号结合T细胞受体删除DNA环(signal joint T-cellreceptor excision DNA circles,sjTRECs);连接介导的PCR(LM-PCR)法检测TCR β链位点重排中间物-重组信号序列(recombination signal sequence,RSS)断点;RT-PCR法检测V(D)J重排第二阶段非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径中的核心蛋白Ku70/Ku80及末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT).结果:在Jurkat细胞DNA中检测到结合区具有多样性特征的TCR Dβ2-Jβ2 sjTRECs和RSS 5'端和3'端断裂点,并检测到TdT、Ku70/Ku80的表达.结论:Jurkat细胞有TCR基因重排的发生.Jurkat细胞可能成为研究RAGs和TCR基因重排与T细胞淋巴瘤的一个潜在的细胞模型.
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重组激活基因与临床疾病
rag1或rag2基因的错义突变可使其编码的重组酶活性部分受损,导致V(D)J重组发生倾向于产生单克隆的活化Th2的改变,结果引起一类严重的联合免疫缺陷综合征(SCID),称为Omenn syndrome(OS).OS的准确诊断有赖于RAGs基因的直接测序分析,它也是目前在SCID和OS家族中调查胎儿是否受其遗传影响的有效方法.RAGs基因编码的重组酶催化V(D)J基因重排时,发生的错误识别可导致抗原受体基因和癌基因染色体易位,是淋巴系统恶性肿瘤发生的重要因素.RAGs还可能与自身免疫性疾病等有关.
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Channel catfish重组激活基因克隆与鉴定
目的尝试用简并引物扩增序列未知的channel catfish基因组DNA中ragl基因的片段并测序,为ragl基因的早期进化模式和遗传学变异情况的研究提供直接的证据.方法基于ragl基因的高度保守设计简并引物,PCR扩增channel catfish基因组DNA中ragl基因的片段,TA克隆并双向测序.将所得序列资料拼接,用多种生物信息学方法分析其ORF、内含子、与其它物种ragI基因及Ragl蛋白的相似性,并做多序列比较和系统进化树分析.结果扩增出3条chan-nel catfish ragl基因的DNA片段.从拼接后的序列中找到一2 235bp的ORF和一293bp的内含子,所得序列与其它物种ragl基因的相似程度高(多大于70%),去除内含子后的channel catfish ragl基因序列与zebrafish、rainbow trout、bull shark的ragl基因cDNA全序列碱基一致的位点占43.9%,自第1 352位碱基至2 925位碱基为53.1%,而自第1位碱基至1 351位碱基为33.2%,有非常显著的差异(P＜0.01).结论用简并引物成功扩增出channel catfish ragl基因的DNA片段.序列在GenBank中的登记号是:AY423858(去除内含子序列),AY423859.ragl基因进化缓慢,高度保守,不同物种ragI基因的变异相对集中在氨基末端的区域.系统进化树分析显示了13种硬骨鱼在进化上关系的亲疏.
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T细胞激活剂对Jurkat细胞重组激活基因表达的影响
目的:研究T细胞激活剂PHA,抗-CD3 mAb, PMA+A23187对人T细胞白血病细胞株Jurkat重组激活基因(RAGs )mRNA表达水平的影响. 方法:采用RT-PCR法检测不同T细胞激活剂作用不同时间后Jurkat 细胞中RAG-1, RAG-2 mRNA,以β肌动蛋白(β-actin)的表达作为内参照进行灰度分析,比较不同组Jurkat细胞RAGs mRNA的表达水平 . 结果:三种T细胞激活剂刺激诱导的Jurkat细胞RAG-1 mRNA表达量明显低于对照组(P＜0.05),且RAG-1 mRNA表达量的下降与刺激诱导作用时间有关;PHA刺激诱导后RAG-2表达量显著低于对照组(P＜0.05);PMA+A23187刺激诱导6, 12 h均未检测出RAG-2 mRNA的表达; 而抗-CD3 mAb作用12 h组RAG-2 mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.05). 结论:Jurkat细胞同时表达RAG1, RAG2 mRNA,并在一定诱导下RAGs表达量发生改变,因此有可能成为研究外周T细胞RAGs表达调节的一个潜在的细胞模型.
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重组激活基因表达应用于淋巴细胞来源肿瘤MRD的检测
[目的] 探讨rag1基因表达在淋巴细胞来源肿瘤MRD检测中的应用价值.[方法] 提取35例淋巴细胞来源肿瘤患者57份外周血标本单个核细胞的基因组DNA和总RNA, 用RT-PCR检测rag1基因表达,用通用引物PCR联合检测IgH 和TCRγ基因重排.[结果] rag1表达检测淋巴细胞来源肿瘤MRD的阳性率显著高于IgH重排/TCRγ重排单独检测(P<0.05);rag1表达检测和IgH、TCRγ基因重排联合检测MRD的阳性率分别是73.7%(42/57)和68.4%(39/57),敏感性分别为2×10-4和1×10-3, 无显著性差异;2种方法检测结果的一致率为80.7% (46/57).[结论] 首次尝试用rag1基因表达检测MRD, 结果表明rag1基因表达可以作为淋巴细胞来源肿瘤外周血MRD检测的良好指标.
