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荧光探针定量PCR技术
PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增,实现目的基因的检测.荧光探针定量PCR(FQ-PCR)是一种新的基因定量检测技术,国外文献多用"实时定量PCR(real time quantitative PCR)"或"TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名)".该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交及光谱技术结合在一起,从而实现了对目的基因的准确定量检测,正发展成为临床实验诊断的常规技术.
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热休克蛋白90(Hsp90)抑制剂荧光标记探针化合物的设计合成
目的 寻找新型Hsp90抑制剂荧光标记探针化合物,用于建立高通量荧光偏振筛选模型.方法 选择高活性的小分子Hsp90抑制剂(化合物1),以氟硼二吡咯为荧光标记物质,对小分子化合物进行标记,并进行荧光偏振测试窗口测定,确定正确的标记位置.结果与结论 设计合成了两个未见文献报道的全新探针化合物,化合物结构经IR、1H-NMR、MS和HR-MS谱确证.初步测试结果表明,当mp90的浓度为50 nmol·L-1时,探针Ⅱ的测试窗口达到了96 mp,能初步满足筛选方法建立的要求,为进一步的优化筛选打下了一定的基础.
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荧光标记探针检测叶酸代谢相关SNP用于多种样本免提取方法的建立
目的 建立叶酸代谢关键酶基因3个SNP位点的荧光标记探针多重检测方法.方法 针对MTHFR基因C677T和A1298C以及MTRR基因A66G 3个SNP位点所在序列设计扩增引物和荧光标记探针.采用探针熔解曲线分析技术,通过熔解曲线Tm值区分特定位点的不同基因型.结果 本研究建立的荧光标记探针多重检测方法,能在单管中同时对3个SNP位点的野生、突变以及杂合基因型进行清晰准确的分型.该方法在抽提DNA样本、口腔拭子以及滤纸血痕样本中均进行了优化和验证.结论 成功的建立起了一种特异性强、灵敏度高、操作简便、检测结果准确稳定、通量较高、结果易判读、适用于多种临床样本类型的叶酸代谢相关SNP检测方法.可以对育龄妇女的叶酸个体化补充进行临床指导,对叶酸代谢异常所引起的多种新生儿疾病、心脑血管疾病的预防具有重要意义.
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荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定中的应用
[目的]用taqman技术建立沙门菌荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法,尝试快速、准确地鉴定沙门菌.[方法]根据沙门菌GenBank Accession NO U25352基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针.将PCR扩增的沙门菌基因片段克隆导入载体,构建的重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定.利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术进行各类菌株的定性鉴定.[结果]应用重组质粒制作的定量曲线,其循环阈值与模板浓度的对数值具有良好的线性关系,相关系数为0.999.检测各类菌株,其中沙门菌41株、H抗原丢失的沙门菌16株均阳性;非沙门菌109株均阴性.[结论]建立了鉴定沙门菌的荧光定量PCR方法,该方法简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.
关键词： 荧光定量聚合酶链反应 沙门菌 荧光标记探针 -
实时荧光PCR技术的研究及其应用进展
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一敏感特异的检测核酸分子的定性方法,在疾病的基因诊断中起重要作用,但传统的PCR技术在临床应用中遇到些难以克服的问题,如PCR后处理需手工操作、难以实现定量、PCR产物的污染等.近年,实时PCR(real-time PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,其以特异性强、灵敏度高、自动化、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点,成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台,并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断.
关键词： 实时荧光定量聚合酶链反应 荧光标记探针 DNA结合染料 标准曲线 -
TaqMan探针检测结直肠癌血浆中微量甲基化EphA7基因
目的 从结直肠癌症患者血浆中分离微量来源于肿瘤细胞的游离DNA,检测甲基化EphA7作为肿瘤标志.方法 提取血浆中微量游离DNA,并以亚硫酸氢钠修饰DNA.根据修饰后的DNA序列,设计EphA7甲基化特异性引物和探针,利用Real Time PCR仪扩增甲基化EphA7基因.结果 从大肠癌患者血浆中检出微量甲基化EphA7基因.结论 应用荧光标记TaqMan 探针Real Time PCR可以检测出结直肠癌患者血浆中微量游离DNA中甲基化EphA7基因,血浆甲基化EphA7可能作为一种新的肿瘤标志物.
