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分析新一代测序技术的无创DNA产前检测在诊断胎儿染色体 非整倍体疾病
目的:探讨新一代测序技术的无创DNA产前检测在诊断胎儿染色体非整倍体疾病中的应用价值.方法:选取在我中心接受孕妇外周血中游离胎儿DNA检测者924例作为研究对象,均为单胎妊娠,根据血清学筛查结果与孕妇年龄将其分为唐筛高危组、高龄组以及其他因素组,均实施新一代测序技术的无创DNA产前检测,对被检测者外周血中游离胎儿DNA实施序列分析,对结果为阳性者进行胎儿染色体核型分析与羊水穿刺,对结果为阴性者进行随访观察.结果:3组孕妇均完成游离胎儿DNA检测,其中有18例患者检测结果为阳性,包含11例21三体,5例18三体,2例45,X体,21三体检测准确率为91.67％,18三体检测准确率为100％,45,X检测准确率为50.00％,结论:对孕妇外周血实施新一代测序技术的无创DNA产前检测,能有效检测18三体与21三体,临床应用价值显著.
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Miseq高通量测序平台用于一起疑似经性传播HIV的溯源调查
目的 建立分析HIV准种的Miseq高通量测序(简称Miseq测序)技术,并尝试用于一起疑似经性传播HIV的溯源调查.方法 采集疑似有传播关系的2例HIV感染者(编号P1、P2)血液样本,并以同一城市与他们无直接传播关系的2例HIV感染者(编号P3、P4)为对照.提取血浆中RNA,逆转录后进行HIV基因亚型分析和Miseq测序.根据测序结果分析样本中HIV的准种分布,比较使用优势准种数目由少到多(5、20、100、500、全部)时所得的基因离散率及系统进化树.结果 4份样本中HIV的基因亚型相同,均为HIV-1重组亚型(CRF) 01 _AE.采用Miseq测序,每份样本获得23 788～37 397条有效核酸序列,代表1 229～1 412个独特准种.P2与P1间的平均基因离散率(3.5％～4.5％)远小于与对照样本间(10.3％ ～ 19.6％,P＜0.01).系统进化树结果显示,P1和P2的准种聚集在一起,而P3和P4的各自单独聚为一簇;当所用的优势准种数目为20或更多时,P1对P2存在并系关系,提示HIV的传播方向是从P1到P2.结论 Miseq测序在HIV感染溯源调查中可以推断传播关系和传播方向,其操作较简便、检测成本较低,具有较高的实用价值.
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CC2D2A基因变异所致Joubert综合征一家系的临床及分子遗传学分析
目的 对临床诊断为Joubert综合征的一家系进行临床和遗传学分析,明确其基因诊断以提供遗传咨询和产前诊断服务.方法 以2013年深圳市妇幼保健院门诊临床诊断为Joubert综合征的一家系为研究对象,采集了该家系的先证者和患病胎儿的病史,采用目标序列捕获及新一代测序技术,对该家系先证者、患病胎儿及其父母双亲进行基因检测,采用Sanger测序法对发现的可能的致病突变进行家系成员验证,结合临床症状体征和综合检测结果,对该家系的Joubert综合征进行临床和分子遗传学分析.结果 先证者婴儿期表现为发作性呼吸急促、肌张力增高,无异常的眼球运动,颅脑MRI提示磨牙征,后发展为共济失调、肌张力减退、明显的智力低下和生长发育迟缓,伴上睑下垂,暂时未发现肝肾功能及视力异常;妊娠中期彩超及MRI提示患病胎儿脑积水征象,无外观畸形.先证者及胎儿同时遗传了分别来自其父亲的CC2D2A基因c.2999A＞ T(p.Glu1000Val)错义突变和其母亲的CC2D2A基因20 ～21外显子的缺失,符合孟德尔复合杂合遗传.其中通过Sanger测序证实c.2999A＞ T(p.Glu1000Val)突变遗传自其父亲,先证者母亲该位点无突变.结论 Joubert综合征在胎儿期中-晚期可体现为脑积水,出生后婴儿期异常的呼吸,也可能表现出肌张力增高,头颅MRI体现为磨牙征,随着年龄增长表现出双侧肢体肌张力降低、共济失调、智力低下和生长发育迟缓,伴上睑下垂;综合临床病史和分子遗传学检测结果可推测CC2D2A基因的c.2999A＞ T(p.Glu1000Val)突变和20～21外显子的缺失复合杂合变异可能是该Joubert综合征家系的致病原因.
关键词： Joubert综合征 CC2D2A基因 基因突变 新一代测序技术 -
新一代测序技术无创产前检测胎儿FGFR3基因突变
目的 探讨新一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)无创产前筛查FGFR3相关疾病的可行性与准确率.方法 4例软骨发育不全、2例致死性侏儒Ⅰ型胎儿基因组DNA(gDNA)片段化后,以相应母体产后血浆游离DNA为背景,按照10%、6%、3%、1%、0.5%的浓度进行稀释,形成30例阳性模拟样本,建立孕妇血浆游离DNA模型,同时采集13例阴性对照孕妇血浆游离DNA,运用NGS技术分别检测FGFR3致病突变位点,计算检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值.结果 30例模拟样本中,胎儿gDNA浓度为10%、6%、3%、1%、0.5%时,突变检出例数分别为6/6、6/6、6/6、3/6、1/6,13例阴性突变检出例数为0/13;胎儿gDNA浓度≥3%时,NGS的灵敏度为100%(95%CI:81.5%~100%),特异度为100%(95%CI:75.3%~100%),阳性预测值为100%(95%CI:81.5%~100%),阴性预测值为100%(95%CI:75.3%~100%).结论 胎儿gDNA浓度≥3%时,NGS可以在孕妇血浆游离DNA模型中准确检出胎儿FGFR3基因突变,提示基于NGS技术的无创产前检测在新发突变或父源遗传疾病的产前诊断领域具有一定的应用前景.
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基因组学在预防出生缺陷中的应用
中国是出生缺陷的高发国，出生缺陷总发生率约为5.6%，出生缺陷在全国婴儿死因中的构成比顺位由2000年的第4位上升至2011年的第2位，达到19.1%。遗传因素是出生缺陷发生的一个重要原因，随着基因组学的研究进展以及基因检测平台的高速发展，使得基因检测在常见的染色体异常、新生儿代谢性疾病及单基因病等出生缺陷预防中的应用越来越广泛。以出生缺陷的三级预防体系为基础，探讨基因组学在其体系中的应用对完善中国出生缺陷的预防工作是非常重要的。
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新一代测序技术及其应用
基因测序技术的出现极大地推动了分子生物学的向前发展.以往应用较多的为Sanger测序法,该传统的基因测序技术为基因测序工作带来了极大的便利,但其高成本和低通量的缺陷限制了其在大规模测序中的应用.新一代测序技术的出现则弥补了传统方法的缺陷,借助其数据产出通量高、测序成本低的显著优势,新一代测序技术为解决一般性的基因分子生物学问题开辟了新的领域[1].
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PKD1基因新突变导致常染色体显性多囊肾病
目的:确定l例常染色体显性多囊肾病(ADPKD)患者致病基因的突变,以明确诊断和指导患者生育.方法:采用高通量测序(next generation sequencing,NGS)技术对患者3个多囊肾致病基因进行检测,并通过Sanger测序进行验证.结果:患者PKD1基因存在插入突变c.11853_11854 insA,从而使其编码蛋白丧失功能.结论:PKD1基因新的致病突变c.11853_11854 insA的发现丰富了ADPKD的发生机制,临床上可通过产前诊断或植入前遗传学诊断预防患者再生育患儿.
关键词： 常染色体显性多囊肾病 PKD1 基因突变 新一代测序技术 -
新一代测序技术诊断新生儿显性营养不良型大疱性表皮松解症1例报告
大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa,EB)是一种以皮肤水疱或大疱为主要表现的遗传性皮肤病.根据国际会议提出的新分类方法1,现将EB分为单纯型(epidermolysis bullosa simplex,EBS)、交界型(junctional epidennolysis bullosa,JEB)、营养不良型(dystrophic epidermolysis bullosa,DEB)和Kindler综合征4个临床类型,涉及角蛋白5、角蛋白4、LamA3、LamB3、LamC2、COL7Al等13个基因,其中DEB是EB中比较少见的类型,在美国EB发病率为9/106,其中约5％为DEB[2].其共同特点是皮肤或黏膜受到轻微伤或压力后即引起水疱,皮损易发生在四肢、关节等处.
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目标序列捕获测序技术及其在疾病相关基因研究中的作用
目标序列捕获测序是指将感兴趣的基因组区域定制成特异性探针与目标基因组DNA在序列捕获芯片(或溶液)进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用新一代测序技术进行测序,以获得目标基因组序列的研究策略.该项技术具有高度灵活性、特异性及覆盖率,操作便捷等特点,该文就目标序列捕获测序技术的原理及其在疾病相关基因研究中的应用作一简要综述.
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基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法学的建立
目的:大量研究证实线粒体DNA(mtDNA)突变与肿瘤发生及进展密切相关,但使用传统测序方法难以高通量、高精确度的检测mtDNA突变,为此本研究建立了基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法.方法:提取肝癌患者癌、癌旁组织以及外周血细胞总DNA,利用PCR技术对线粒体基因组进行富集并对PCR产物进行平末端、粘性末端连接或对PCR引物进行氨基修饰,构建mtDNA测序文库.经Illumina HiSeq 2000平台测序后利用生物信息学方法与人类mtDNA参考序列进行比对,并进行测序数据分析.结果:通过对不同质量基因组DNA进行评估后,发现三对引物法适用于大部分DNA样本的mtDNA富集.进一步我们发现PCR引物的氨基修饰可显著提高测序数据覆盖均一性,降低测序成本.结论:本研究利用新一代测序技术通过对线粒体DNA富集方法以及测序覆盖度均一性进行优化,建立了一套灵敏、特异、高通量的mtDNA突变检测策略,为mtDNA突变与疾病研究提供了新方法.
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3例戊二酸血症Ⅰ型患者遗传学分析
目的 明确新生儿疾病筛查发现的高度疑似戊二酸血症Ⅰ型的诊断,并进行相关的遗传学分析.方法 收集患儿临床数据,采用基因捕获高通量测序技术的遗传代谢病诊断panel对疑似患儿进行基因诊断,用Sanger测序技术对该家系进行验证.并查找相关文献进行遗传学分析.结果 3例生化指标疑似戊二酸血症Ⅰ型的患儿通过基因测序技术均发现存在GCDH致病基因复合杂合突变位点,第1例为c.109110delCA和c.416C>G,第2例为c.892G>A和c.261506-433delinsATA,第3例为c.1235C>A和c.1244-2A>C,其中c.261506-433delinsATA和c.109110delCA为新发现的突变位点,经测序证实突变位点均遗传自父母双方.结论 新一代测序技术有助于明确戊二酸血症Ⅰ的诊断,为疾病的正确治疗和遗传咨询提供可靠依据.
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应用改良的方法检测常染色体显性遗传多囊肾基因突变
目的:常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)是常见的遗传性肾脏疾病,主要是由PKD1和PKD2基因突变引起的.其中,PKD1包含46个外显子,编码区域大概为13 kb,而PKD2有约3 kb的编码区域,含有15个外显子.然而传统的ADPKD基因检测方法繁琐、费时,本研究即旨在建立方便快捷的突变筛查方法. 方法:根据临床和实验室检查人选3个互不相关的中国汉族ADPKD家系.利用新一代测序技术(NGS),针对PKD1和PKD2外显子,剪接位点和10 bp内含子侧翼序列进行基因芯片捕获,检出的变异经过筛选,并与单核苷酸多肽数据库进行比对. 结果:通过与人类基因突变数据库核对,本研究新鉴定的PKD1中c.7318delG,c.5884C＞T和继往报道的PKD2中c.916C＞T杂合变异可能是这3个家系的致病性突变.PCR联合Sanger序列分析证实家系中上述杂合突变的存在,在家系中呈现基因型与表现型共分离;并分别导致PKDI编码的氨基酸发生移码(p.Asp2440Thrfs* 180)及无义突变引发PKD1(p.Gln1962*)和PKD2(p.Arg306*)蛋白的提前中止. 结论:我们利用NGS技术建立了快速分析ADPKD遗传变异的方法,并成功应用于3个家系,鉴定两个新发突变,可作为疑似ADPKD及家系成员的常规筛查手段.
关键词： 常染色体显性遗传性多囊肾 PKD1 Pkd2 新一代测序技术 -
新一代基因测序技术有力推动分子眼科学发展
分子生物学技术已经广泛、深入地整合到眼科的疾病诊断与治疗中,并且极大地促进了眼病的精确诊断和前沿治疗的发展.近十年来,新一代基因测序技术高速发展,从早期的454技术、Solexa测序和SOLiD测序发展到现在的HiSeqX 10高通量测序,在医学和生物学各个领域广泛整合与应用,尤其在眼科的单基因遗传病领域的应用已十分成熟.随着技术发展与应用增加,新一代测序技术不但具有通量高、速度快的特点,且其成本也在快速降低.现基于新一代基因测序技术的方法、特点,介绍其在眼科中的应用及部分标志性研究成果,展望了未来该技术在眼科临床和基凶诊断上的应用前景.
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下一代基因测序技术在新发再发传染病研究中的应用
近十年来,下一代测序技术逐渐成熟并在多个研究领域得到广泛应用.此文简要介绍了目前一些常见的下一代测序技术平台的原理及特征,尤其是在近几年几起新发再发传染病疫情暴发中,如何尽快实现对病原体进行定位及溯源.
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新一代测序技术在乳腺癌中的应用
新一代测序技术以其自身的优势在当今基因研究中应用广泛, 几乎取代了传统测序方法, 在包括乳腺癌的各种复杂疾病的研究中发挥着重要作用. 新一代测序技术具有速度快、 测序长、 通量高、 准确率高等优点, 在乳腺癌中的应用相当广泛, 特别是运用新一代测序技术进行基因组DNA序列分析和风险预测给乳腺癌的研究做出了极大贡献.
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miRNA的检测方法概述
miRNA是一种由19~22个成熟的核苷酸组成的小分子非编码RNA(non-coding RNA molecules， ncRNAs)。迄今为止，miRNA在所有动植物中都有发现，它们约占所有基因组的4%。miRNA已被证明在生命的正常生长发育中起作用，它还与人类许多疾病如癌症、心脑血管疾病等相关。每个miRNA在特定的器官、组织或细胞中的确切作用和功能仍有待研究。然而，miRNA很短，这成为检测它的一个限制因素。因此，无论是在组织或细胞水平上，敏感的miRNA检测方法的发展都将成为miRNA生物学的一个重要里程碑。本文对miRNA检测方法进行了总结，重点介绍能应用于病理标本的miRNA检测方法及其它一些有效检测方法，为进一步研究miRNA的表达和功能提供技术支持。
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五例新生儿肝内胆汁淤积症患儿SLC25A13基因的突变分析
目的 明确5例新生儿肝内胆汁淤积症患儿的分子机制.方法 应用新一代测序技术对患儿的SLC25A13基因进行外显子捕获检测,对突变位点进行Sanger测序验证.用PolyPhen 2软件对新突变的致病性进行分析.结果 5例患儿均携带SLC25A13基因的复合突变,共发现8个突变位点,其中2个既往未见报道(c.1357A＞G和c.1663dup23).5例患儿的父母均为突变携带者.结论 SLC25A 13基因的突变可能是5例患儿的发病原因,所携带的突变以851de14和1638 1660dup为主.新发现的c.1357A＞G和c.1663dup23突变丰富了SLC25A13基因的突变谱.
关键词： 新生儿肝内胆汁淤积症 SLC25A13基因 新一代测序技术 -
一例新生儿型氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ缺乏症的诊断
目的 明确1例具有高氨血症疑似氨甲酰磷酸合成酶 Ⅰ 缺乏症患儿的分子遗传学病因.方法 应用新一代测序技术对患儿基因组进行外显子捕获测序,对突变位点进行患儿及其父母的Sanger测序验证;用SIFT、PolyPhen-2和MutationTaste软件对新突变进行致病性分析.结果 测序结果显示患儿携带CPS1基因c.1631C>T(p.T544M)和c.1981G>T(p.G661C)复合杂合突变,经Sanger测序验证c.1631C>T(p.T544M)来自于父亲,为已报道突变,c.1981G>T(p.G661C)遗传自母亲,为未经人类基因突变数据库报道的新突变.结论 CPS1基因复合杂合突变可能是氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ缺乏症患儿的遗传学病因,新发现的突变扩展了CPS1基因的突变谱.
关键词： 氨甲酰磷酸合成酶I缺乏症 CPS1基因 新一代测序技术 -
一例罕见的丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症女性患儿的分析
目的 分析1例表现为肌无力、脑部磁共振图像异常、血乳酸增高的女性新生儿的临床及遗传学特征.方法 对患儿进行临床及实验室检查,应用新一代测序技术对其家系进行遗传学分析.结果 先证者为足月小样儿,临床表现为肌无力、脑部磁共振图像异常、血乳酸增高、代谢性酸中毒等.基因检测发现其PDHA1基因存在一新生错义突变c.1133G＞A(p.R378H),为已报道的致病突变.结合其临床表现,该患儿被诊断为丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症(pyruvate dehydrogenase complex deficiency,PDCDD),给予维生素B1、辅酶Q10、左旋肉碱治疗,并建议生酮饮食.4月后随访,其血乳酸降至正常水平,但四肢肌张力偏低.结论 确诊了1例由PDHA1基因错义突变所引起的PDCDD,使患儿在婴儿期就得到了及时的治疗.新一代测序技术为这类疾病提供了有力的诊断工具.
关键词： 丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症 PDHA1基因 新一代测序技术 -
新一代测序技术确诊一例先天性大疱性鱼鳞病样红皮病
目的 对1例疑诊为先天性大疱性鱼鳞病样红皮病的患儿进行临床及遗传学分析.方法 对患儿进行临床检查,并应用新一代测序技术对其进行分析.结果 患儿自出生即有躯干及四肢的红斑和水泡,之后发展为角化过度.基因测序发现其KRT10基因存在新生突变c.482T＞G(p.L161W),既往未见报道.结论 确诊了1例由KRT10基因突变所致的先天性大疱性鱼鳞样红皮病.
关键词： 先天性大疱性鱼鳞样红皮病 KRT10基因 新一代测序技术
