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H2O2诱导的氧化应激对锌指蛋白ZNF580表达的影响
[目的]研究过氧化氢(H2O2)对EA.hy926内皮细胞锌指蛋白580(zinc finger 580,ZNF580)表达的影响.[方法]先以不同浓度H2O2作用内皮细胞EA.hy926,测定细胞上清中乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)确定细胞的损伤程度.选择适宜的H2O2浓度作用细胞,在不同浓度和不同时间点提取总RNA和蛋白,以RT-PCR检测ZNF580的mRNA表达水平,同时westernblotting检测其蛋白表达差异.[结果]随着H2O2浓度的升高,LDH释放随之升高,不同浓度H202作用EA.hy926内皮细胞后,ZNF580在mRNA转录水平和蛋白水平的表达均有增加,并呈现浓度依赖的趋势.同样的浓度为100 μmol/L的H2O2作用EA.hy926内皮细胞不同时间后,检测可知ZNF580 mRNA和蛋白水平的表达增加,与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]一定浓度和时间的外源性H2O2作用内皮细胞可促进ZNF580在一定程度表达上调.
关键词： 锌指蛋白580 过氧化氢 EA.hy926细胞 -
人ZNF580基因的原核表达及单克隆抗体的制备
[目的]原核表达纯化人锌指蛋白(zinc finger protein 580,ZNF580)并制备抗人ZNF580单克隆抗体.[方法]将构建的重组质粒pET30a-ZNF580转化大肠杆菌BL21(DE3),由异丙基-β-D-半乳糖苷(Isopropyl beta-D-galactosidase,IPTG)诱导表达并纯化目的蛋白.将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备针对ZNF580的特异性单克隆抗体并通过ELISA和Western blotting方法鉴定.[结果]含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经ItPTG诱导表达后,产物蛋白分子量约为19 kDa,通过将Sp2/0细胞与免疫鼠的脾细胞融合获得了1株能稳定表达ZNF580抗体的杂交瘤细胞株(H4E4C5),其分泌的单克隆抗体的IgG亚类IgG2b,ELISA检测腹水抗体效价为1∶1.28×105,Western blotting结果显示抗ZNF580单克隆抗体具有良好的特异性.[结论]本实验成功表达并纯化了ZNF580蛋白并制备了抗ZNF580蛋白的单克隆抗体,为进一步研究锌指蛋白ZNF580的功能奠定了基础.
