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DOC-2基因对卵巢癌细胞周期的影响
目的:探讨DOC-2基因对卵巢癌细胞周期的影响.方法:将卵巢癌细胞(TC-1)和转染空载体的卵巢癌细胞(TC-pcDNA3.1)作为对照组,与转染DOC-2的卵巢癌细胞(TC-p93)同时进行消化收集后,经流式细胞仪检测,对比各组间细胞周期的改变.结果:TC-1细胞经DOC-2转染后,其受阻于G1期的细胞增多,同时S期细胞相应减少,而单纯转染空载体对细胞周期并不产生明显影响.结论:DOC-2基因可改变卵巢癌细胞TC-1的细胞周期,它可能会成治疗卵巢癌的目的基因之一.
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DOC-2对卵巢癌细胞HO-8910致瘤力的影响
背景与目的:作为近年发现的新的肿瘤抑制基因,DOC-2的作用机制还不完全清楚.本实验的目的在于观察DOC-2转染后对卵巢癌细胞系HO-8910在克隆形成率、细胞周期、裸鼠致瘤能力等方面的影响,并对其作用机制进行初步探讨.方法:实验分3组:卵巢癌细胞系HO-8910(无DOC-2基因的表达)、8910-P93(经转染并表达DOC-2基因)、8910-pcDNA3.1(转染空载体pcDNA3.1),首先通过软琼脂克隆形成实验比较3组细胞克隆形成率的差异,之后利用流式细胞仪观察其细胞周期的变化,后用裸鼠荷瘤实验进一步验证DOC-2对肿瘤细胞致瘤能力的影响.结果:卵巢癌细胞系HO-8910在转染DOC-2后其克隆形成率明显降低,与转染前差异明显(P《0.05),同时G1和G2期细胞明显增多而S期细胞明显减少,移植瘤裸鼠荷瘤实验显示HO-8910-P93细胞在裸鼠体内生长缓慢,肿瘤体积及重量均明显低于对照组(P《0.05).结论:DOC-2基因能明显抑制卵巢癌细胞系HO-8910的致瘤力.
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DOC-2在卵巢癌细胞系中的表达及其生物学功能
人类DOC-2(differentially expressed in ovarian cancer 2)位于染色体5p13,长约35 kb,含有15个外显子和14个内含子.cDNA共3 268 bp,编码长度为770个氨基酸、相对分子质量约为82 500的蛋白质.研究表明,DOC-2属于Disabled(Dab)基因家族,故又称为DAB2(Disabled 2).DOC-2是一个信号转导分子,不仅参与细胞的生长分化,而且还具有肿瘤抑制功能,但其具体作用机制尚不完全清楚.
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大肠癌组织中DOC-2和c-Fos蛋白的表达
目的：探讨DOC-2和c-Fos在大肠癌组织中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化SP法检测132例大肠癌组织及48例正常肠黏膜组织中DOC-2和c-Fos蛋白的表达情况。结果：大肠癌组织与正常肠黏膜组织中DOC-2的阳性表达率分别为31.1%（41/132）和81.2%（39/48）,c-Fos的阳性表达率分别为56.1%（74/132）和12.5%（6/48）,2组间差异均有统计学意义（χ2分别为35.911,27.051,P〈0.001）。大肠癌组织中DOC-2的表达与患者年龄、性别、组织学类型、分化程度和临床分期无关（P〉0.05）,但与淋巴结及肝转移有关（P〈0.05）;c-Fos蛋白的表达与患者年龄、性别、组织学类型、临床分期、淋巴结及肝转移无关（P〉0.05）,但与分化程度有关（P〈0.05）。大肠癌组织中DOC-2与c-Fos蛋白的表达呈负关联（rP=-0.368,P=0.001）。结论：DOC-2和c-Fos蛋白的异常表达可能在大肠癌的发生发展中起重要作用。
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肿瘤抑制基因DOC-2真核表达载体的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达鉴定
目的构建肿瘤抑制基因DOC-2的真核表达载体pCDNA3.1-p93,将其转入人卵巢癌细胞系HO-8910中,对其基因表达进行相关检测,为进一步研究DOC-2的功能奠定基础.方法利用XhoI酶切含有p93cDNA的质粒得到p93cDNA 基因片段,将其连接入真核表达载体pCDNA3.1,并通过酶切鉴定.用脂质体介导法将真核表达载体pCDNA3.1-p93 转染HO-8910,通过G418筛选稳定达克隆；用免疫组化法观察人DOC-2蛋白在HO-8910中的表达.结果构建了DOC-2的真核表达载体pCDNA3.1-p93,并通过酶切鉴定.免疫细胞化学结果显示pIRES2-EGFP-p93成功转入HO-8910中.结论成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-p93并在HO-8910中得到稳定表达,为研究DOC-2蛋白的功能奠定了基础.
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兔抗人DOC-2抗血清的制备与鉴定
目的利用大肠杆菌中表达的融合蛋白GST-nDOC-2,制备兔抗DOC-2的多克隆抗体.方法将克隆有人DOC-2氨基端PID结构域(暂命名为nDOC-2)的原核表达载体pGEX-4T-nDOC-2转化大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白GST-nDOC-2,经包涵体洗涤后,用其免疫兔,制备兔抗人DOC-2抗血清.并以ELISA、Western blot和免疫组化的方法对抗血清进行鉴定.结果用ELISA法测定抗血清的效价为1:32 000;Western blot结果显示对应于GST-nDOC-2融合蛋白位置上有阳性条带;免疫组化结果显示人正常卵巢上皮细胞胞浆呈阳性染色,人卵巢浆液性囊腺瘤上皮细胞染色呈弱阳性,而人卵巢癌浆液性囊腺癌上皮细胞呈阴性染色.结论成功制备了兔抗人DOC-2抗血清,为研究DOC-2的功能提供了有利的工具.
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人DOC-2氨基端PID结构域的克隆与原核表达
目的:克隆人DOC-2氨基端PID结构域(暂命名为nDOC-2),并在原核细胞中表达.方法:用RT-PCR从正常人卵巢组织中扩增nDOC-2基因,并克隆到载体pUC-19中.经测序证实后,用BamH I/EcoR I双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX- 4T-1,并转化E.coli DH5α菌株.取工程菌,用IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定.结果:①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人nDOC-2基因.②经IPTG诱导的重组质粒pGEX- 4T-nDOC-2表达出相对分子质量(Mr)约为50 000的融合蛋白,与预期的结果相符.结论:成功克隆到人DOC-2氨基端PID结构域,并在E.coli DH5α中表达出GST-nDOC-2 融合蛋白.
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真核表达载体pIRES2-EGFP-p93的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达
目的:构建肿瘤抑制基因DOC-2的真核表达载体pIRES2-EGFP-p93,将其转入人源性卵巢癌细胞株HO-8910中,并得到稳定表达.方法:利用XhoI酶切含有p93cDNA 的质粒得到p93cDNA基因片段,将其正向连接入真核表达载体pIRES2-EGFP,并通过酶切鉴定.用脂质体介导的方法,将真核表达载体pIRES2- EGFP-p93 转染人卵巢癌细胞系HO-8910,通过G418筛选稳定表达克隆;分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察人DOC-2蛋白在卵巢癌细胞系HO-8910中的表达.结果:构建了DOC-2的真核表达载体pIRES2-EGFP-p93,并通过酶切鉴定.在荧光显微镜下,转染了pIRES2-EGFP-p93的人卵巢癌细胞HO-8910发出绿色荧光,荧光全部集中于胞浆内.免疫细胞化学染色结果显示转染了pIRES2-EGFP-p93的人卵巢癌细胞HO-8910胞浆呈棕黄色,而转染空载体的细胞呈阴性染色.结论:成功构建了真核表达载体转染了pIRES2-EGFP-p93,并在人卵巢癌细胞系HO-8910中稳定表达,为研究DOC-2蛋白对卵巢癌细胞的作用奠定了基础.
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DOC-2对卵巢癌细胞TC-1增殖的影响
目的:研究DOC-2对卵巢癌细胞TC-1的影响.方法:用脂质体介导的转染技术,将含有全长DOC-2 cDNA的真核表达重组质粒和空载体质粒,分别导入不表达DOC-2的TC-1细胞,观察细胞增殖能力的改变.结果:共获得10个DOC-2转染克隆(TC-p93)和6个空载体克隆(TC-pcDNA3.1);转染后细胞形态与TC-1细胞无显著差别;TC-p93细胞生长明显比TC-pcDNA3.1和TC-1细胞慢;TC-p93细胞形成集落数显著少于TC-1与TC-pcDNA3.1细胞;TC-p93 G1期细胞百分比高于TC-1和TC-pcDNA3.1细胞.结论:DOC-2基因可明显抑制癌细胞生长,可作为卵巢癌基因治疗的目的基因之一.
