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哺乳动物性别决定相关基因及其调控机制
哺乳动物早期胚胎性腺具有双重分化潜能,后经精确而复杂的级联调控过程形成睾丸或卵巢,这一过程称为性别决定.近年来,一些关键调控基因的成功鉴别,为揭示终导致两性形成的基因激活和调节的整体网络提供了可能.本文以人类和小鼠为例,综述了哺乳动物性别决定的基因调控机制.
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密度梯度离心法富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞的方法学
目的探讨密度梯度离心法(density gradient centrifugation,DGC)富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞的可行性及其在产前基因诊断中的价值. 方法采用密度梯度离心法富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞,以流式细胞分析鉴定富集细胞,同时对富集前后孕妇外周血DNA进行男性性别决定基因(sex-determining region Y,SRY)检测. 结果 5例孕妇外周血单个核细胞靶细胞群糖蛋白A(glycophorinA,GPA)阳性细胞富集前平均含量为0.02 ‰～0.1 ‰,而富集后平均含量高达0.5 %～2.8 %;24例孕10～40周孕妇(包括以上5例)中,孕妇外周血DNA富集前SRY基因男性诊断符合率69.2 %(9/13),诊断总符合率83.3 %(20/24),而富集后分别为84.6 %(11/13),91.6 %(22/24),11例怀女胎的孕妇富集前、后均未检出SRY基因. 结论密度梯度离心法可从孕妇外周血中富集胎儿细胞,且所得细胞已基本满足体外扩增单拷贝基因所需的模板量,该方法可应用于非损伤性产前诊断.
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骨髓间充质干细胞对大鼠硅沉着病纤维化形成的影响
目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠硅沉着病(矽肺)纤维化形成的影响,并初步探讨其机制.方法 体外分离、培养BMSCs.将54只健康雌性SD大鼠随机分为生理盐水对照组、硅沉着病模型组、干细胞移植组,每组18只.分别在造模后1、3、7、14、28及56d处死各组大鼠,HE染色观察肺组织形态变化；Masson染色观察胶原增生情况；免疫荧光双标技术检测性别决定基因(sry)和肺泡表面活性蛋白C(SP-C)示踪雄性大鼠BMSCs在雌性硅沉着病大鼠肺组织内的分布及分化情况；免疫印迹法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达情况.结果 HE及Masson染色显示,细胞移植组大鼠肺组织肺泡炎、肺纤维化程度及胶原面积均轻于模型组.免疫荧光双标显示,细胞移植组的雌性大鼠肺组织中有sry阳性的细胞,并且部分sry阳性细胞同时表达SP-C.免疫印迹法结果显示,模型组肺组织TNF-α和MMP-9的蛋白表达均较对照组增高(P＜0.05),不同时间点在肺组织内的表达有不同的特点；BMSCs移植组肺组织TNF-α和MMP-9的蛋白表达在各时间点均低于模型组,高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 BMSCs可以减轻二氧化硅(SiO2)所致的大鼠硅沉着病纤维化程度,可能与其在肺组织中分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞,降低肺组织中TNF-α和MMP-9的蛋白表达有关.
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斯氏按蚊性别决定基因fruitless的鉴定及其性别可变剪接分析
目的 分离、鉴定和分析斯氏按蚊性别决定基因fruitless(Anstfru).方法 通过生物信息学方法与分子生物学方法获得了Anstfru基因的全长.通过RT-PCR方法验证Anstfru的性别可变剪接模式与时间表达特点.通过与已知物种FRU蛋白比较,分析斯氏按蚊FRU蛋白结构特点与分子进化特征.结果 分离并鉴定Anstfru基因全长,其在雌、雄蚊中通过可变剪切形成性别特异性mRNA.Anstfru在1～2龄阶段幼虫阶段开始表达,表达量随后逐渐升高,在成蚊中表达量高.FRU蛋白具有保守的BTB与锌指功能结构域区.结论 Anstfru具有保守的昆虫性别决定基因fru表达特征与功能结构域,对其深入研究将为其终应用于蚊虫雌雄分离技术,推动昆虫不育技术(Sterile insect technique,SIT)在蚊媒传染病防治上的应用.
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8个假肥大型肌营养不良症家系产前基因诊断
假肥大型肌营养不良症(DMD)是一种严重的常见致死性X-连锁隐性神经肌肉系统遗传病,发病率约为1/3 500,我们用18对外显子引物[1,2]、6对内含子(CA)重复序列引物[3]和性别决定基因SRY引物,有效地对8个DMD家系进行产前基因诊断.
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胎儿细胞父源性人类白细胞抗原DQA基因检测
随着应用孕妇外周血中胎儿细胞进行无创性产前诊断研究的进展,多数研究者利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)或荧光原位杂交的方法检测性别决定基因(sex-determining region Y,SRY)[1-3],作为鉴定胎儿细胞存在或已成功分离的手段,但这些方法仅局限于检测妊娠男性胎儿的孕妇外周血中的胎儿细胞.人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-DQA基因属于HLA-Ⅱ类抗原[1],该基因的多态性和高变异性使HLA-DQA基因位点具有较好的鉴别力[2].我们应用PCR-反向点杂交法,检测孕妇外周血中胎儿细胞父源性HLA-DQA基因,旨在推动无创性产前基因诊断的基础研究.
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X-连锁脊柱骨骺发育不良家系孕早期产前诊断一例
2007年本实验室对1例X-连锁脊柱骨骺发育不良家系(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,X-SEDL)进行基因诊断[1],确诊该家系的先证者(图1:I:1)为位于染色体Xp22.2的SEDL基因的4号外显子c.209G＞A突变致病,其女儿(图1:Ⅱ:1)为该致病基因突变携带者(c.209G/A杂合突变).2008年,该女性携带者于妊娠19周时曾在本院对胎儿(图1:Ⅲ:1)采集的羊水细胞进行基因诊断,证实为男性胎儿伴遗传突变基因而引产.此次妊娠11周时要求在孕早期对胎儿(图1:Ⅲ:2)进行产前诊断.签署手术知情同意书后,行绒毛膜穿刺术取绒毛组织.部分绒毛组织标本经常规细胞培养、收获制片后G显带染色体核型分析.部分绒毛组织提取基因组DNA,进行Y染色体性别决定基因(sex determining region of Y chromosome,SRY)检测,判断性别,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)条件参照文献[2].参照相关研究[1]直接PCR扩增SEDL基因4号外显子,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、回收纯化后进行DNA序列分析.同时选择Xp22区域内位于SEDL基因附近的4个短串联重复(shorttandemrepeat,STR)位点(包括DXYS10085、DXYS10092、DXYS10093和DXYS233)进行PCR扩增检测,PCR扩增引物及反应条件见参考文献[3],进行单体型分析.
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SOX2 OCT4 β-连环蛋白p120-连环蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率呈上升和发病年轻化的趋势.侵袭和转移是重要的生物学特征,乳腺癌患者转移是死亡的主要原因.随着分子生物学研究领域的发展,人们对乳腺癌发生及演进机制的了解不断深入,乳腺癌的分子生物学发病机制和预后因素的探讨已成为目前研究的热点[1].当前在乳腺癌的研究中,对β-连环蛋白和p120-连环蛋白(p120ctn)的检测已有一些报道[2],但是联合检测性别决定基因相关转录因子-2 (SOX2)、POU5fl转录因子-4 (OCT4)、β-连环蛋白、p120ctn在乳腺癌中的表达及意义未见报道.本研究旨在对上述4个指标在乳腺癌中的表达情况及SOX4、OCT4、β-连环蛋白、p120ctn四者的相关性进行初步分析,以进一步探讨乳腺癌发生发展的分子调控机制,为临床诊断防治和预后判断提供理论指导.
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巢式PCR扩增性别决定基因序列检测兔骨髓间充质干细胞移植治疗关节软骨缺损的修复组织来源
目的:明确骨髓间充质干细胞移植到关节软骨损伤处后,该处修复组织的细胞来源,以了解组织修复的过程.方法:实验于2006-01/2007-01在浙江省医学科学院生物工程所完成.①实验材料:3月龄新西兰大白兔,清洁级,体质量约2 kg,由浙江省实验动物中心提供.②实验方法:利用兔性别决定基因序列设计两对PCR引物.取雄性新西兰大白兔进行骨髓间充质干细胞的分离培养与扩增.取雌性新西兰大白兔,暴露其膝关节软骨,用电钻钻孔造成膝关节软骨内侧直径4.5 mm深3.5 mm的全层关节软骨缺损,达软骨下骨.一侧植入骨髓间充质干细胞/胶原海绵,另一侧仅植入胶原海绵.③实验评估:于术后1,2,3,4,5个月取兔关节软骨缺损修复处组织提取总DNA,进行PCR扩增,鉴定移植物中是否存在性别决定基因,以明确细胞来源.结果:移植后1,2,3,4,5个月移植雄兔骨髓间充质干细胞及胶原海绵的关节修复处组织提取的DNA,用设计的引物通过PCR扩增出一条约200 bp大小的条带,大小与阳性对照一致;而另一侧仅移植胶原海绵的关节软骨修复处组织提取的DNA,用设计的引物通过PCR扩增后未发现有条带.PCR扩增阳性样本测序分析显示,每个样本碱基序列一致,与GenBank上性别决定区Y基因组gb|AY785433.1|比较,扩增的样本序列与标准序列完全一致,序列同源性达100%.结论:雌兔关节骨髓间充质干细胞/胶原海绵复合物移植处的新生组织中含有雄性组织,提示新生软骨中有移植的雄性骨髓间充质干细胞分化来的软骨细胞.
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小鼠造血干细胞增殖与分化性能的研究
本文选择Y染色体特异的性别决定基因(Sry)作为新的细胞遗传标志,采用PCR技术研究了小鼠造血干细胞的增殖与分化性能.将雄鼠骨髓细胞输注给经致死剂量射线照射的雌性受体小鼠,PCR测试结果表明,所有CFU-S均为供体起源.供体来源的CFU-S在其输入体内后,可通过增殖、分化形成各系造血细胞;但CFU-S中的纤维母细胞和CFU-S重建造血后受体小鼠骨髓中的纤维母细胞均为受体起源.由此可见,小鼠骨髓中的CFC-S是一类造血干细胞,它不具有分化为纤维母细胞的性能.
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利用母体血浆游离胎儿DNA进行胎儿SRY基因定量检测
目的 探讨胎儿游离DNA在无创性产前诊断中的应用价值.方法 行产前诊断的孕妇87例,分为中期妊娠(16～24周)61例(中孕组)和早期妊娠(11～14周)26例(早孕组),采用实时荧光定量PCR方法,利用Taqman探针对妊娠早、中期孕妇血浆游离的胎儿Y染色体性别决定基因(sex-determining region of Y-chromosome,SRY)进行扩增和定量分析.结果 孕13周后的样本均得到特异性扩增,特异度和灵敏度均为100％；中孕组男性胎儿SRY检测的平均DNA浓度为155.46 copies/mL血浆,实测范围为43.6～326.8 copies/mL血浆；早孕组平均浓度为26.42 copies/mL 血浆,实测范围为14.3～73.3 copies/mL血浆.结论 采用荧光实时定量PCR在妊娠早、中期可稳定检测到胎儿游离DNA,可作为孕期性连锁遗传性疾病研究或产前诊断的有效补充手段.
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哺乳动物性别决定基因的研究进展
目的 了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能.方法 查阅本领域国内外文献并进行综述.结果 SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定.结论 性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义.
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红细胞生成素对骨髓间充质干细胞干性的影响
有研究表明,当体外培养的骨髓间充质干细胞(MSC)形成集落时,其多向分化潜能具有逐渐丧失的倾向,且在体外扩增过程中MSC出现了自发分化的倾向,限制了其在临床上的应用.我们前期实验发现,在体外促红细胞生成素(EPO)能促进MSC的增殖和迁移能力.本实验拟用EPO作用于MSC,观察其未分化相关转录因子端粒酶逆转录酶(TERT)、POU5fl转录因子-4(OCT4)、性别决定基因相关转录因子-2(SOX2)和多潜能维持因子(Nanog)mRNA的表达情况,探讨EPO对MSC干性的影响.
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性发育异常患者SRY基因分析
应用SRY基因编码区1对特异寡核苷酸引物进行基因组DNA扩增,结合单链构象多态性分析,银染显色,探讨性别决定基因(sex-determining region on Y,SRY)对性发育异常患者临床诊断的意义.结果:5例患者中,2例46,XX男性显示与男性相同的特异扩增带;3例46,XY女性中2例无男性特异扩增带,1例显示SRY基因片段扩增,经单链构象多态性分析,显示与正常男性扩增片段相同的单链泳动带型.支持SRY基因是男性性别决定的关键基因的假说,提示SRY基因的调节基因等可能参与协同作用.
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同性婚姻立法机理:同性情感发展的自然性和社会性分析
同性情感的发育起源和遗传机制,以及发展的自然性和社会性,是美国联邦政府公布法案对同性情感实施法律保护的重要证据,同性婚姻合法化成为人类婚姻认知理念的历史性进步.本文探讨同性情感的社会学和生物科学史的自然性,阐述生物学进展在该历史进程中起到的重要作用:第一,同性情感社会认同的发展过程是一个漫长的社会历史过程,探讨该历程的特性对认清历史的过程和现实的合理性具有重要意义;第二,在动物界同性趋向与环境密切相关,对人类同性情感行为学中性别趋向是否有类似机理存在,可能有一定借鉴价值;第三,2016年发现性别起源的古菌嵌入学说也为性别的产生提供了崭新的研究途径,为认识同性情感的起源和社会现实提供了更加令人信服的自然性证据;第四,染色体性别决定学说相关的Xq28同性恋基因可能是生物性别决定的重要因子,经典生物学与现代生物学的有机结合使我们对同性情感的生物学基础有了更进一步的认识.
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埃及伊蚊性别决定基因Transformer 2的鉴定与表达分析
目的：分离、鉴定和分析埃及伊蚊性别决定基因Transformer 2（Aaetra2）。方法通过生物信息学方法与分子生物学方法获得了Aaetra2基因的全长。通过与已知物种tra2的比较，分析Aaetra2的基因结构特点与分子进化特征，通过RT-PCR方法验证Aaetra2的时间与组织表达特点。结果分离并鉴定Aaetra2-α与Aaetra2-β两个基因，它们位于染色体不同部位，通过选择性启动子的剪切策略进行自我调控，转录多种mRNA。埃及伊蚊TRA2蛋白具有保守的RRM、RS1、RS2和linker功能结构域区。Aaetra2表达方式无时间特异性的，从卵持续性表达至成虫阶段，且无性别特异性表达与组织特异性表达。结论 Aaetra2具有保守的昆虫性别决定基因tra2的功能结构域与表达特征，对其深入研究将为其终应结合释放携带显性致死基因的昆虫技术应用于蚊虫的防制提供理论依据。
关键词： 埃及伊蚊 transformer2 性别决定基因 显性致死基因 -
男性染色体异常三例
例1男,27岁,结婚3年未育.患者表型、智力正常.双侧睾丸小,阴茎小,精液检查3次均为无精.Y染色体无精子因子(azoospermia factor, AZF)区域微缺失筛查:采用多重PCR技术对AZF区4个亚区的8个序列标签位点(sequence tagged sites, STS)位点:AZFa区sY84、sY86,AZFb区sY127、sY134、sY129,AZFc区sY254、sY255,AZFd区sY152及性别决定基因(sex-determining region of Y, SRY)基因扩增,未发现缺失.
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双胎同为真两性畸形2例报道
1 病例报告例1 ,双胞胎之"姐",14岁,社会性别女性.因外生殖器发育异常于2003年8月入院.患者出生时即被发现外生殖器异常,阴蒂肥大,按女性抚养.7～8岁时身高生长迅速,高于同龄儿童,声音粗、声调低,阴蒂开始增大增粗.12岁月经初潮,3～4天/30～50天,经量少,轻微痛经.近1年阴蒂有勃起.蹲位排尿,尿流散、不畅.查体:身高150 cm,指距151 cm.女性体态,体毛女性分布,无喉结,皮肤细腻面部有痤疮.两侧乳房、乳头、乳晕发育良好.心肺腹无异常.妇科检查:阴毛呈倒三角形分布,阴蒂长约4 cm、直径2 cm、周径6 cm.双侧阴唇融合,阴蒂下2 cm处可见尿生殖窦口,被融合的阴囊遮盖,双侧阴囊及腹股沟区未触及性腺.肛查盆腔可触及子宫, 双侧附件无异常.双肾上腺B超检查未见异常.盆腔B超检查:子宫4.0 cm×3.0 cm×2.5 cm,左侧卵巢2.5 cm×1.2 cm,内见卵泡,右侧卵巢3.2 cm×1.9 cm,内有细带状分隔.查染色体46,XX,性别决定基因SRY(-).血皮质醇、促肾上腺皮质激素、尿17-羟皮质醇、17-酮皮质醇正常,血睾酮16.99 nmol/L(正常成年女性2.1±0.8 nmol/L,男性6.07～27.01 nmol/L),雌二醇184.01 pmol/L.
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性发育异常患者SRY基因的检测与分析
性别发育异常直接影响患者的身心健康,长期以来一直是医学遗传学、优生学研究的重点,而人类Y染色体上性别决定基因(sex-determining region gene on Y,SRY)的发现则使性发育异常的病因学研究取得了重大突破.我们对3例典型患者进行了SRY基因序列的检测,结合染色体核型分析、组织病理学检查,明确其性分化异常类型,并分析可能的性发育异常病因,为临床的诊断与治疗提供参考.
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性别决定基因在性别分化、生育与节育中的作用
目的：探讨性别决定基因在性别分化、生育与节育中的作用。方法：观察周围已婚人群生育性别、不孕不育、再婚再育的比例与性别决定基因的关系。结果：已婚两年以上不育占已婚家庭中的16%，经各种治疗仍不孕不育者占4%。其中与性别决定基因相关造成不孕不育者约占8/16。
